一种能促进白三叶地上组织生长的高效解磷菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能促进白三叶地上组织生长的高效溶磷菌，其分类命名为阴沟肠杆菌（Enteuobactor cloacae）；菌株号为BS1；保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11788，保藏日期为2015年12月04日。将该高效溶磷菌BS1接种于白三叶后，对白三叶地上组织具有极显著的促生作用。

【技术实现步骤摘要】


本专利技术涉及微生物
，特别涉及一种能促进白三叶地上组织生长的高效解磷菌及其应用。

技术介绍

磷元素作为植物生长所必需的营养元素参与着植物的代谢活动，并且对于植物具有增强抗逆性、促进生长等作用。研究表明，土壤中的可利用的磷元素很难满足植物生长对磷元素的需求量，而且磷肥中很大一部分磷元素都与Fe2+、Fe3+、Ca2+和Al3+等阳离子结合形成很难被植物吸收的难溶解的磷酸盐化合物[1-2]。因此，如何提高植物对磷元素的利用率，对于植物的生长及土壤环境的改善都具有重要的意义。
溶磷菌作为植物根际有益的微生物可将难溶性磷转化为植物可以吸收的磷元素，对于改良土壤环境及促进植物生长均具有重要的意义。一些高效溶磷菌一方面具有分泌植物激素的能力，从而促进植物的生长；另一方面其较高的溶磷能力可以促进植物对无机磷及有机磷的吸收，从而满足植物对磷元素的需求，进一步促进植物的生长。因此，对于植物根际溶磷菌的筛选及其促生作用的研究具有重要的意义。

技术实现思路

本专利技术的目的是提供一种能促进白三叶地上组织生长的高效解磷菌，使其能够实现通过接种白三叶而对白三叶地上组织生长带来显著的促进作用。
本专利技术这种能促进白三叶地上组织生长的高效解磷菌是从白三叶根际分离出一株高效解磷菌，使用钼蓝比色法测定该菌株溶解磷酸钙的能力，溶磷量为424.85μg·mL-1，促生实验研究表明该菌株促进白三叶地上部分生长。
根据形态特征观察及生理生化试验结果，查《伯杰细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》可知，本专利技术的高效解磷菌为阴沟肠杆菌Enteuobactorcloacae，菌株命名为BS1。
该菌株为专利技术人与2010年10月在贵州省独山县境内栽培白三叶根际土壤样品中分离获得。该菌株保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11788，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2015年12月04日。
本专利技术的菌株BS1可用于接种白三叶，能够极显著的促进白三叶地上组织的生长。
本专利技术所提供的高效溶磷菌接种的方法具体包括以下步骤：
（1）将菌株活化培养，将保存的菌株在PKO培养基上划线，28℃，培养3天，重复培养3次。所述的PKO培养基配制为：Ca3(PO4)23.0g、(NH4)2SO40.5g、KCl0.2g、MnSO40.03g、FeSO4·7H2O0.003g、NaCl0.2g、MgSO4·7H2O0.03g、葡萄糖10g、酵母粉0.5g、琼脂15-20g、蒸馏水1000ml，pH6.8~7.2。
（2）待培养基中长出无杂菌的菌落，挑取单菌落接种于0.5ml的菌悬液于50mlLB培养基中，28℃震荡培养3-5d。所述的LB培养基配制为：蛋白胨10.0g、NaCl6.0g、酵母粉5.0g、蒸馏水1000ml、pH6.8~7.2。
（3）白三叶种子经0.1%升汞表面消毒5min后再经75%酒精消毒3min，用无菌水冲洗干净。
（4）对照组：将消毒过的种子浸泡在无菌水中3d；试验组：将消毒过的种子浸泡在高效溶磷菌菌液中3d。
（5）待种子出现白芽，将种子移栽到试管菌培养基中，在25℃光照16h条件下培养40d，所述的试管菌培养基配制为：Ca(NO3)20.945g、KNO30.506g、NH4NO30.08g、MgSO40.493g、Ca3(PO4)20.62g、铁盐溶液2.5ml、微量元素液2ml、琼脂4.0-6.0g、蒸馏水1000ml、pH6.0；所述的铁盐溶液配制为：FeSO4·7H2O2.78g、EDTA二钠3.73g、蒸馏水500ml；所述的微量元素液配制为：KI0.0215g、MnSO41.15g、NaMoO4·2H2O0.00125g、CuSO40.00125g、蒸馏水500ml。
（6）接种菌株BS1对白三叶生长具有显著促进作用，表现为地上鲜重和干重均极显著高于未接种菌株BS1的植株（p＜0.01）。
附图说明
图1为本专利技术实施例提供的目标菌株溶磷圈特征图；
图2为专利技术实施例提供的菌落特征图
图3为专利技术实施例提供的菌落血平板特征图
图4为专利技术实施例提供的菌株BS1镜检特征图
图5为专利技术实施例提供的菌株BS1对白三叶的促生效果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。
实施例1：高效溶磷菌菌株BS1的获得
高效溶磷菌菌株BS1的分离筛选过程如下：
（1）高效溶磷菌菌株BS1的分离：
土壤于2010年10月取于贵州省独山县境内以5点法采取栽培白三叶根际样品，采样地位于东经106o12′至108o18′、北纬25o04′至27o29′之间，平均海拔高度997m，年均气温13.6-19.6℃，年均降雨量1100-1400mm。土壤类型为黄壤土，主要成分：全氮0.218g·kg-1、水解氮156.98mg·kg-1、有效磷15.02mg·kg-1、速效钾10.20mg·kg-1、有机质1.695g·kg-1、pH5.97。本专利技术所述的高效溶磷菌具体分离方法见参考文献[4]。
（2）高效溶磷菌菌株BS1的初筛：
高效溶磷菌菌株BS1的初筛和溶磷能力测定，应用含磷酸钙的无机磷培养基[5]，菌株纯化、活化及保存用LB培养基[6]。将分离纯化好菌株活化2-3次后，用无菌牙签挑取菌落点接种于PKO培养基上，每菌株于一个平板上四个点，28℃恒温培养15d。在第5、10及15d时分别观察和记录菌株出现透明圈大小（D）、菌落大小（d），依D/d大小初步筛选菌株（表1）。在含磷平板培养基上菌株均表现出较强的溶磷能力，可溶解培养基中的磷从而产生较大的透明圈（图1，图2）。
（3）高效溶磷菌菌株BS1的复筛：
①在150mL三角瓶中装入50mL已灭菌磷酸钙无机磷培养基，分别接种1mL培养1-2d的菌株菌悬液，设不接菌对照，每菌株重复3次，在28℃、150r/min恒温摇床上振荡培养7d。
②第8d时将培养液在10000r/min转速下离心10min，按钼锑抗比色法测定其溶磷量[7]，溶磷量由扣除对照值，以P2O5表示，测定获得菌株的溶磷量为424.85±43.03μg·mL-1；
③取5mL上清液，以0.1mol/LNaOH溶液（酚酞为指示剂）滴定，计算菌株分泌有机酸量为12.00±1.15mmol·L-1[8]。
实施例2：高效溶磷菌菌株BS1的鉴定过程如下：
高效溶磷菌菌株BS1的形态学鉴定；
划线单菌落，观察菌落形态，菌落表面光滑不透明，边缘整齐。挑取待鉴定的菌种分别划线于营养琼脂平板上，培养48小时后进行液体培养，挑取菌种接种于营养肉汤培养基地中培养培养48小时后，液体培养基中呈扩散性混浊。镜检结果显示，菌株呈短杆菌，表面光滑，存在周身鞭毛（图4）。
菌株BS1具有下述性质：
1.菌落形态学特征:
划单菌落，观察菌落形态，菌落表面光滑不透明，边缘整齐。挑取待鉴定的菌种分别划线于营养琼脂平板上，培养48小时后进行液体培养，挑取菌种接种于营养肉汤培养基地中培养培养48小时后，液体培养基中呈扩散混浊。镜检结果显示，菌株呈短杆菌，表面本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能促进白三叶地上组织生长的高效溶磷菌，其分类命名为阴沟肠杆菌（Enteuobactor cloacae）；菌株号为BS1；保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11788，保藏日期为2015年12月04日。

【技术特征摘要】
1.一种能促进白三叶地上组织生长的高效溶磷菌，其分类命名为阴沟肠杆菌（Enteuobactorcloacae）；菌株号为BS1；保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11788，保藏日期为2015年12月04日。
2.根据权利要求1所述的能促进白三叶地上组织生长的高效溶磷菌，其特征在于：该菌株...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小利，王茜，李小冬，陈莹，
申请(专利权)人：贵州省草业研究所，
类型：发明
国别省市：贵州;52