一种定量检测棉花材料群体中MON757转化体含量的方法技术

本发明专利技术“一种定量检测棉花材料群体中MON757转化体含量的方法”，属于生物技术领域,包括如下步骤：(1)获取MON757转化体特异性片段序列的曲线方程，(2)获取棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线方程，(3)随机选取待测棉花材料群体中的多个材料，研磨后混合提取待测DNA，(4)以待测DNA为模板进行MON757转化体荧光定量PCR反应测得待测DNA中MON757转化体的拷贝数；进行所述ACP1基因荧光定量PCR反应测得待测DNA中ACP1基因的拷贝数；(5)MON757转化体含量＝(MON757转化体拷贝数/ACP1基因拷贝数)×2，本发明专利技术为特异性鉴定群体中转基因抗虫棉MON757转化体的有无和含量提供了便利，具有高效快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，有非常高的实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
特别是涉及定量检测棉花材料群体中MON757转化体含量的方法。
技术介绍
转基因棉花是全球种植的主要转基因作物之一，也是我国种植面积最大的转基因作物。2014年，我国710万农户种植了转基因棉花390万公顷，占棉花总种植面积93％，高于2013年90％的比例。目前我国批准商业化种植的转基因棉花主要有国内研发的转cry1Ab/Ac融合基因的抗虫棉和孟山都公司的转基因cry1Ac基因的抗虫棉MON531转化体(http://www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/)。转基因棉花MON757转化体是由孟山都公司研发的，采用MON531转化体同一质粒载体进行转化。MON757转化体与MON531转化体在棉花基因组的插入位点、插入片段结构都不相同(https://www.aphis.usda.gov/brs/aphisdocs/94_30801p.pdf)。目前，MON757转化体在美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、日本、韩国和南非等批准种植或允许用作食品饲料原(http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp？EventID＝55)，但在我国作为转化体尚未获得批准种植。然而，汪巧等2011年在检测我国市场上的转基因棉花时发现，转基因抗虫棉鄂杂棉1号与新棉33B(新棉33B是MON531转化体的衍生品种)具有相同构建，但转化>事件并不相同，采用GenomeWalking的方法获得了鄂杂棉1号的旁侧序列，并建立了转化体特异性定性检测方法。本实验室在偶然的实验中，通过序列比对发现，鄂杂棉1号旁侧序列与专利US6893826中公开的MON757转化体序列高度相似，因此可以确定鄂杂棉1号的转基因转化体来源于MON757转化体。鄂杂棉1号中检出MON757转化体也说明以MON757转化体为亲本获得的育种后代已经流传到我国。对棉花材料中MON757转化体的含量测定，是检测转基因棉花质量的重要指标，也可以为转基因的标识提供技术依据。但是目前国内外尚未有MON757转化体定量PCR方法的报道。
技术实现思路
针对上述领域中的空白，本专利技术提供一种可检测待测棉花中是否含有MON757转化体及其含量的试剂盒和方法，本专利技术公开的技术方案如下：一种定量检测棉花材料群体中MON757转化体含量的方法，包括如下步骤：(1)获取MON757转化体特异性片段序列的标准曲线方程，所述曲线方程是以MON757转化体纯合材料的基因组DNA稀释成梯度浓度后作为模板，以梯度浓度的对数值为横坐标，对所述梯度浓度的模板进行MON757转化体荧光定量PCR反应所得的荧光信号值为纵坐标，拟合出曲线方程；所述MON757转化体荧光定量PCR反应采用的引物和探针如下：757-3QF：5‘-GGCATGCACATACAAATG-3’，757-3QR：5‘-CCCATTATTATTCTGTTGTTG-3’，探针：757-3QP：5‘-FAM-ACGAACGGATAAACCCTTTCTGGA-BHQ1-3’；(2)获取棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线方程：所述曲线方程是采用步骤(1)中获取MON757转化体特异性片段序列的曲线方程所采用DNA模板，以模板的浓度对数值为横坐标，对模板进行ACP1基因荧光定量PCR反应所得的荧光信号值为纵坐标，拟出出来的方程；其中所述荧光定量PCR反应采用的引物、探针、PCR反应体系和程序采用国家标准《农业部1943号公告-1-2013》中所记载的定量检测ACP1基因的方法；(3)随机选取待测棉花材料群体中的多个材料，研磨后混合提取待测DNA，(4)以待测DNA为模板进行MON757转化体荧光定量PCR反应，读取荧光信号值并带入所述MON757转化体特异性片段序列的曲线方程计算得到待测DNA中MON757转化体的拷贝数；以待测DNA为模板进行所述ACP1基因荧光定量PCR反应，读取荧光信号值并带入棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线方程计算得到待测DNA中ACP1基因的拷贝数；(5)MON757转化体含量＝(MON757转化体拷贝数/ACP1基因拷贝数)×2。优选地所述MON757转化体荧光定量PCR反应的体系为：PremixExTaqTM10μL，10μmol/L上、下游引物各1.5μL，10μmol/L探针0.75μL，50×ROX0.4μL，DNA模板2μL，补超纯水至总体积20μL；MON757转化体荧光定量PCR反应的程序为：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火和延伸34s，扩增反应进行40个循环，在60℃收集PCR扩增荧光信号。由于转基因抗虫棉MON757转化体在美国等已经批准种植近20年，在我国进口的棉花及其加工产品中很难避免有上述成分。而且在我国部分省区的转基因棉花中也检测到这个转化体。本专利技术通过序列比对发现，鄂杂棉1号旁侧序列与专利US6893826中公开的MON757转化体序列高度相似，因此可以确定鄂杂棉1号的转基因转化体来源于MON757转化体。本专利技术还在以MON757转化体连接区序列(SeqIDNo.9)为靶标，设计了定量PCR引物和探针，并建立了MON757转化体特异性的定量PCR检测方法，适合棉花批量样品中MON757转化体的含量测定。基于实验数据，本专利技术提供了用于定量检测棉花批量样品中MON757转化体的含量的检测方法，以及试剂盒。综上，因此本专利技术为特异性定量测定转基因抗虫棉MON757转化体提供了便利，这些方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。附图说明图1.转基因棉花MON757转化体定量PCR检测的引物和探针示意图序列中小写字母为插入序列，大写字母为棉花基因组序列图2.MON757转化体的定性PCR检测1-6：MON757纯合样品；7-14：MON757杂合样品；15-20：非转基因样品；21-22：空白对照；M：DL2000图3.单粒转基因棉花材料的MON757转化体定性PCR检测A.鄂杂棉7号F1B.华惠4号图4.定量PCR方法扩增曲线和标准曲线A.MON757转化体；B.ACP1基因具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook...

【技术保护点】
一种定量检测棉花材料群体中MON757转化体含量的方法，包括如下步骤：(1)获取MON757转化体特异性片段序列的曲线方程，所述曲线方程是以MON757转化体纯合材料的基因组DNA稀释成梯度浓度后作为模板，以梯度浓度的对数值为横坐标，对所述梯度浓度的模板进行MON757转化体荧光定量PCR反应所得的荧光信号值为纵坐标，拟合出来的方程；所述MON757转化体荧光定量PCR反应采用的引物和探针如下：757‑3QF：5‘‑GGCATGCACATACAAATG‑3’，757‑3QR：5‘‑CCCATTATTATTCTGTTGTTG‑3’，探针：757‑3QP：5‘‑FAM‑ACGAACGGATAAACCCTTTCTGGA‑BHQ1‑3’；(2)获取棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线方程：所述曲线方程是采用步骤(1)中相同的MON757转化体纯合材料的基因组DNA，稀释成梯度浓度后为模板，以模板的浓度对数值为横坐标，对模板进行ACP1基因荧光定量PCR反应所得的荧光信号值为纵坐标，拟合出来的方程；其中所述荧光定量PCR反应采用的引物、探针、PCR反应体系和程序采用国家标准《农业部1943号公告‑1‑2013》中所记载的定量检测ACP1基因的方法；(3)随机选取待测棉花材料群体中的多个材料，研磨后混合提取待测DNA，(4)以待测DNA为模板进行MON757转化体荧光定量PCR反应，读取荧光信号值并带入所述MON757转化体特异性片段序列的曲线方程计算得到待测DNA中MON757转化体的拷贝数；以待测DNA为模板进行所述ACP1基因荧光定量PCR反应，读取荧光信号值并带入棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线方程计算得到待测DNA中ACP1基因的拷贝数；(5)MON757转化体含量＝(MON757转化体拷贝数/ACP1基因拷贝数)×2。...

【技术特征摘要】
1.一种定量检测棉花材料群体中MON757转化体含量的方法，包括如下步骤：
(1)获取MON757转化体特异性片段序列的曲线方程，
所述曲线方程是以MON757转化体纯合材料的基因组DNA稀释成梯度浓度后作为模板，
以梯度浓度的对数值为横坐标，对所述梯度浓度的模板进行MON757转化体荧光定量PCR反
应所得的荧光信号值为纵坐标，拟合出来的方程；
所述MON757转化体荧光定量PCR反应采用的引物和探针如下：
757-3QF：5‘-GGCATGCACATACAAATG-3’，
757-3QR：5‘-CCCATTATTATTCTGTTGTTG-3’，
探针：
757-3QP：5‘-FAM-ACGAACGGATAAACCCTTTCTGGA-BHQ1-3’；
(2)获取棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线方程：
所述曲线方程是采用步骤(1)中相同的MON757转化体纯合材料的基因组DNA，稀释
成梯度浓度后为模板，以模板的浓度对数值为横坐标，对模板进行ACP1基因荧光定量PCR反
应所得的荧光信号值为纵坐标，拟合出来的方程；
其中所述荧光定量PCR反应采用的引物、探针、PCR反应体系和程序采用国家标准《农
业部1943号公告-1-2013》中所记载的定量检测ACP1基因的方法；
(3)随机选取待测棉花材料群体中的多个材料，研磨后混合提取待测DNA，
(4)以待测DNA为模板进行MON757转化体荧光定量PCR反应，读取荧光信号值并带入
所述MON757转化体特异性片段序列的曲线方程计算得到待测DNA中MON757转化体的拷
贝数；
以待测DNA为模板进行所述ACP1基因荧光定量PCR反应，读取荧光信号值并带入棉花内
标准基因ACP1基因的标准曲线方程计算...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢家建，彭于发，杨阳，王叶，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11