一种检测单分子DNA复制的图像可视化方法技术

本发明专利技术公开了一种检测单分子DNA复制的图象可视化方法。该方法包括：对含有dNTP、两端分别固定于空心DNA折纸上两个不同位置的单链DNA及结合单链DNA的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系进行原子力显微镜扫描，通过所述原子力显微镜成像观察DNA的复制。本发明专利技术的方法在单个分子水平上跟踪DNA的复制过程，记录单链DNA与单个DNA聚合酶的相互结合、DNA链与DNA聚合酶间的移动，以及单链DNA链转变成双链DNA链的全过程，还可捕捉衬底表面上DNA链各种各样的状态分布，以及DNA与DNA聚合酶相互作用时的变化情况，有助于理解生物分子行为作用机制并获取分子事件过程的时间尺度和空间尺度上的数据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及纳米
，具体地涉及一种检测单分子DNA复制的图像可视化方法。
技术介绍
DNA复制主要是指以一条DNA单链为模版链，按照AT和CG配对原则，合成出另外一条DNA单链的过程。在体内，DNA复制非常重要，与生物体的发生，发展和演化等生命过程密切相关。在体外，也涉及到众多现代生物技术包括DNA测序、法医检验、纳米生物传感检测以及广泛采用的DNA扩增技术等。DNA复制是一种生物分子反应过程，采用先进的荧光共振能量转移(FRET)技术和光镊技术，已经获得了诸多DNA复制反应的动态过程信息如DNA复制速度等。图像可视化的研究可获取分子事件过程的时间尺度和空间尺度上的数据，可为DNA复制的过程和机制研究提供可靠的信息。但在图像可视化方面，在单分子水平上，目前仅有针对RNA转录的图像可视化方法的有关报道，而对于单分子水平的DNA复制由于缺乏直接观察方法，以图像形式对DNA复制的动态过程进行描述和表征一直无法解决。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少一种直接以图象形式对DNA复制的动态过程进行描述和表征的方法，提供了一种检测单分子DNA复制的图像可视化方法，本专利技术的方法将具有纳米级成像水平的原子力显微术(AFM)与新发展起来的纳米技术DNA折纸相结合，在单个分子水平上跟踪DNA的复制过程，记录单条DNA链与单个DNA聚合酶的相互结合、DNA链与DNA聚合酶间的移动，以及最终单链DNA链转变成双链DNA链的全过程。同时，还可捕捉衬底表面上DNA链各种各样的状态分布，以及DNA与DNA聚合酶相互作用时的变化情况，有助于理解生物分子行为作用机制，并可获取分子事件过程的时间尺度和空间尺度上的数据，为DNA复制的过程和机制研究提供可靠的信息。本专利技术通过以下技术方案来解决上述技术问题：本专利技术技术方案之一：一种检测单分子DNA复制的图象可视化方法，所述方法包括以下步骤：对含有dNTP、两端分别固定于空心DNA折纸上两个不同位置的单链DNA及结合所述单链DNA的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系进行原子力显微镜扫描，通过所述原子力显微镜成像观察DNA的复制。本专利技术中，所述空心DNA折纸可以为本领域常规的空心DNA折纸，包括各种不同形状的DNA折纸，如矩形或三角形空心DNA折纸，较佳地为中间空心的等边三角形，更佳地为内边长为30-50nm的中间空心的等边三角形，最佳地为内边长为40-50nm的中间空心的等边三角形，如内边长为50nm的中间空心的等边三角形。所述空心DNA折纸的图案可根据需要设计，只要图案的中间存在空隙能够容纳待同时可检测DNA链高度的距离以及DNA聚合酶即可。所述空心DNA折纸的制备方法可以为本领域常规的方法，较佳地由单链脚手架链DNA和订书钉单链DNA自组装形成，订书钉单链DNA用于固定脚手架链DNA形成目标图形，更佳地包括以下步骤：将单链脚手架链DNAM13mp18与A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL混合于TAE-Mg2+缓冲体系，从95℃退火至20℃，退火速率为0.1℃/10s，其中，所述单链脚手架链M13mp18与所述A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL的摩尔浓度比可以为本领域常规的比例，较佳地为1∶10。组装好的DNA折纸用40mMTris-乙酸、1mMEDTA、12.5mMMgCl2，pH8.0缓冲液超滤。所述订书钉链DNA集合ABCL为所述订书钉链DNA集合ABCL为2010年3月17日发表在JAmChemSoc.第132卷第10期第3248-3249页的题为Goldnanoparticleself-similarchainstructureorganizedbyDNAorigami的论文的SupportinOnlineInformation中的S11-S16页所记载的从A01至Loop的DNA序列的集合，总共有208条序列，可自组装成等边三角形DNA折纸，作者为DingB，DengZ，YanH，CabriniS，ZuckermannRN，BokorJ，所述JAmChemSoc.为《美国化学学会期刊》。本专利技术中，所述单链DNA(ssDNA)可以为本领域常规的单链DNA，其作为DNA复制的模板被所述DNA聚合酶Klenow片段结合。所述单链DNA可以通过本领域常规的方式固定于所述空心DNA折纸的两个不同位置上，较佳地，所述单链DNA通过与所述空心DNA折纸内侧边缘中的两个不同位置上各多出的一段分别与所述单链DNA5’端与3’端互补的序列杂交配对而被固定到所述空心DNA折纸上并位于所述空心DNA折纸的中央，或者所述单链DNA的5’端与3’端分别固定在所述空心DNA折纸的外侧的同一边上的两个不同位置。当所述单链DNA被固定到所述空心DNA折纸上并位于所述空心DNA折纸的中央时，所述两个不同的位置不在所述空心DNA折纸内侧同一直线的边缘上，但可以分别位于不同直线的边缘上，例如分别位于三角形三条边中的两条边上，或位于矩形四条边中的两条边上；更佳地，所述单链DNA模板通过其5’端与其3’端分别与订书钉链SEQIDNO.17的5’端的20个碱基与订书钉链SEQIDNO.98的3’端的20个碱基杂交固定到所述DNA折纸上并位于所述DNA折纸中央。所述杂交可以为本领域常规的方法，较佳地为将所述单链DNA与所述空心DNA折纸混合后升温至50℃后以0.5℃/min的速率退火至15℃，再用TAE-Mg2+缓冲液超滤。所述dNTP的终浓度可以为本领域常规的使DNA合成能够正常进行的浓度，较佳地为15.6μM。所述缓冲体系可以为本领域DNA聚合酶Klenow片段工作的常规缓冲体系，所述缓冲体系中的缓冲成分较佳地为TAE-Mg2+缓冲液，所述TAE-Mg2+缓冲液为40mMTris-乙酸、1mMEDTA、12.5mMMgCl2，pH8.0。当所述单链DNA的5’端与3’端分别固定在所述空心DNA折纸的外侧的同一边上的两个不同位置时，所述单链DNA较佳地为所述空心DNA折纸中的一条边的外侧的单链脚手架DNA缺失配对的订书钉链后所形成的单链DNA。本专利技术中，对所述缓冲体系进行原子力显微镜扫描可以为本领域常规的操作，较佳地按以下步骤进行：1)将所述单链DNA两端分别固定于所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测单分子DNA复制的图象可视化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：对含有dNTP、两端分别固定于空心DNA折纸上两个不同位置的单链DNA及结合所述单链DNA的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系进行原子力显微镜扫描，通过所述原子力显微镜成像观察DNA的复制。

【技术特征摘要】
1.一种检测单分子DNA复制的图象可视化方法，其特征在于，所述方
法包括以下步骤：对含有dNTP、两端分别固定于空心DNA折纸上两个不同
位置的单链DNA及结合所述单链DNA的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲
体系进行原子力显微镜扫描，通过所述原子力显微镜成像观察DNA的复制。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述空心DNA折纸为等边三
角形。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述空心DNA折纸由单链脚
手架链DNA和订书钉单链DNA自组装形成，订书钉单链用于固定脚手架
链形成目标图形。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述单链脚手架链DNA为
M13mp18，所述订书钉单链DNA的核苷酸序列为A17与C33两条链分别
替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合
ABCL，所述订书钉链DNA集合ABCL为2010年3月17日发表在JAm
ChemSoc.第132卷第10期第3248-3249页的题为Goldnanoparticleself-
similarchainstructureorganizedbyDNAorigami的论文的SupportinOnline
Information中的S11-S16页所记载的从A01至Loop的DNA序列的集合；
所述单链DNA的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.3所示。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述单链DNA通过其5’端与
其3’端分别与订书钉链SEQIDNO.1的5’端的20个碱基与订书钉链SEQ
IDNO.2的3’端的20个碱基杂交固定到所述DNA折纸上并位于所述DNA
折纸中央。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述杂交为将所述单链DNA
与所述空心DNA折纸混合后升温至50℃后以0.5℃/min的速率退火至15℃，
再用TAE-Mg2+缓冲液超滤。
7.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述单链DNA的5’端与3’端
分别固定在所述空心DNA折纸的外侧的同一边上的两个不同位置。
8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述单链DNA为所述空心

\tDNA折纸中的一条边的外侧的单链脚手架DNA缺失配对的订书钉链后所
形成的单链DNA。
9.如权利要求1所述方法，其特征在于，对所述缓冲体系进行原子力
显微镜扫描包括以下步骤：
1)将所述单链DNA两端分别固定于所述空心DNA折纸上两个不同位
置，制得单链DNA-空心DNA折纸；较佳地，在所述空心DNA折纸的内侧
边缘的订书钉链序列中选择两个不同位置各多出一段核苷酸序列分别与所
述单链DNA模板的5’端与3’端序列配对，使所述单链DNA模板通过5’端
与3’端杂交固定到所述DNA折纸上并位于所述DNA折纸中央；所述空心
DNA折纸较佳地由包括以下步骤的方法制得：将单链脚手架链DNA
M13mp18与A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQID
NO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL混合于TAE-Mg2+缓冲体系，从
95℃退火至20℃，退火速率为0.1℃/10s，其中所述订书钉链DNA集合ABCL
为2010年3月17日发表在JAmChemSoc.第132卷第10期第3248-3249页

【专利技术属性】
技术研发人员：虞国凯，张萍，李宾，周星飞，王奇，
申请(专利权)人：中国科学院上海应用物理研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31