用于肿瘤疗法的犬尿氨酸耗竭酶的施用制造技术

本发明专利技术描述了涉及具有犬尿氨酸酶活性的蛋白的用途的方法和组合物，例如，在某些方面，可以是公开了能够降解犬尿氨酸的改性犬尿氨酸酶。而且，本发明专利技术的某些方面提供了使用公开的蛋白或核酸治疗犬尿氨酸耗竭癌症的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景本申请要求2013年8月30日提交的美国临时申请号61/872,132和2014年4月30日提交的美国临时申请号61/986,366的优先权，其全部内容通过引用并入本文。本专利技术是在由美国国家卫生研究院颁发的第R01CA154754号拨款下借助政府资助进行的。该政府在本专利技术中享有某些权利。1.
本专利技术一般涉及使用耗竭L-犬尿氨酸或L-3-羟基犬尿氨酸的酶治疗癌症的组合物和方法。更特别地，本专利技术关注具有L-犬尿氨酸降解活性的适用于人类治疗的细菌酶和哺乳动物酶的工程学、药理优化和用途。2.相关技术的描述癌细胞所致的吲哚胺-2,3-双加氧酶亚型(IDO1或IDO2)过表达或用于表达这两种酶中任意一种的癌浸润性白细胞的重编程，已被证明对减弱对癌症的适应性免疫应答具有深刻的影响。IDO1和IDO2以及酶色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)，其通过基质细胞的表达可以通过一些肿瘤诱导，催化色氨酸(Trp)分解代谢为L-犬尿氨酸(KYN)中的限速步骤(Godin-Ethier等,2011)。使用LAT1型氨基酸交换剂，肿瘤将细胞质KYN分子交换为细胞外Trp分子(Kaper等,2007)，其对免疫细胞具有局部提高KYN水平同时局部耗竭Trp水平的双重作用。相邻免疫细胞使KYN内在化，其中该KYN作为芳烃受体(AHR)的活性配体，该芳烃受体导致通过免疫细胞分化和/或凋亡诱导引起肿瘤耐受的多种细胞因子和趋化因子的表达(DellaChiesa等,2006；Opitz等,2011；Song等,2011)。另外，由犬尿氨酸，尤其犬尿喹啉酸形成的其它KYN相关化合物也通过充当孤儿GPCRGPCR35的激动剂发挥了免疫抑制的作用。通过IDO1或TDO的抑制对KYN形成的抑制(和因此KYN新陈代谢副产物(包括犬尿喹啉酸、3-羟基犬尿氨酸和喹啉酸)形成的抑制，作为癌症靶点已经受到显著的关注(Chen和Guillemin,2009；Rutella等,2009；Prendergast,2011)。用于IDO1的底物类似物抑制剂(如1-DL-甲基色氨酸)已被开发并已在克服癌症诱导肿瘤耐受，从而恢复天然免疫系统抗肿瘤的能力中显示初步前景(Lob等,2009)。然而，色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)也产生KYN，其也在肿瘤中频繁表达，且1-DL-甲基色氨酸不抑制这种酶(Pilotte等,2012)。目前在1期和2期临床试验中也额外关注了1-DL-甲基色氨酸的D-异构体(1-D-MT)。反常的是，1-D-MT能够上调IDO1的表达，实际上增加了KYN的水平并且诱导了某些癌症的免疫抑制(Opitz等,2011)。控制KYN的肿瘤产生是许多研究的焦点，且具有治疗尤其如乳腺癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌等癌症的潜力。已知KYN能抑制增殖以及诱导T细胞和NK细胞的凋亡(Opitz等,2011；Mandi和Vacsei,2012)使肿瘤能够躲避患者免疫系统的探测和破坏。KYN是芳烃受体(AHR)的有效配体，该芳烃受体在T细胞中的激活诱导分化为CD25+FoxP3+T调节细胞(Tregs)(Mezrich等,2010)。KYN还已显示能预防细胞因子介导的特异性受体(NKp46和NKG2D)的上调，该特异性受体是NK介导细胞杀死肿瘤细胞系所必须的(DellaChiesa等,2006)，该行为也可能通过其对AHR的激动作用来介导(Shin等,2013)。也有将升高的血清KYN水平与在多种类型的癌症中存活减少联系起来的临床证据。在健康患者中，血清中的KYN水平在0.5至1μM的范围。在患有产生KYN的癌症类型(如弥漫性大B细胞淋巴瘤)的患者中，测量血清KYN水平高达10倍(Yoshikawa等,2010；deJong等,2011；Yao等,2011)，在接受同样治疗方案的淋巴瘤患者中预后存活；与对于那些KYN水平高于1.5μM的患者仅仅58％的存活相比，那些血清水平低于1.5μM的患者显示89％的3年存活率。这一存活差异归因于KYN的免疫抑制作用(Yoshikawa等,2010)。小分子IDO抑制剂(如1-D-MT)的用途，已经证实控制KYN水平在恢复免疫功能中的效用，但是1-D-MT所致的IDO1上调的脱靶效应，和对于TDO和IDO1亚型的抑制缺乏令人担忧。本专利技术公开了在肿瘤和/或血液中特异性耗竭KYN和其代谢产物的酶的用途。KYN耗竭酶用于降低KYN浓度来治疗IDO1、IDO2或TDO表达的肿瘤，从而预防肿瘤介导的致耐受性作用而且介导肿瘤消融的促炎应答。显著地，用于耗竭KYN和KYN新陈代谢副产物的酶的使用，绕过如上所述与IDO亚型和TDO小分子抑制剂相关的问题，并且进一步彻底绕过非常普遍伴随小分子药物和导致不可预测的毒性和副作用的脱靶效应。专利技术概要通过提供包含能够降解L-犬尿氨酸和3-羟基-L-犬尿氨酸并在血清中显示癌症疗法所需的良好药物代谢动力学的细菌多肽序列和哺乳动物多肽序列的酶，本专利技术的方面克服本领域的主要缺陷。在一些方面，犬尿氨酸酶可对犬尿氨酸具有比对3’-OH犬尿氨酸更大的催化活性。可以使用来自细菌物种的犬尿氨酸酶。此类酶可以具有选自由SEQIDNO：7和13-52或其改性版本组成的组的氨基酸序列。尤其是，该治疗剂可以源自荧光假单胞菌酶(Pseudomonasfluorescens)的犬尿氨酸酶(Pf-KYNU)。可选地，可以使用来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)的犬尿氨酸酶。该治疗剂可以源自梭状冻胶样杆菌(Mucilaginibacterpaludis)犬尿氨酸酶。进一步，为了预防由于同种异体犬尿氨酸酶的免疫原性所致的不良反应，可以使用智人(Homosapiens)酶或其它显示与人类酶具有>95％的序列同一性的灵长类动物犬尿氨酸酶。例如，新型酶可以具有选自由SEQIDNO：7-9组成的组的氨基酸序列。在其它方面，可以有包含天然的或改性的人类或灵长类动物犬尿氨酸酶的多肽，该犬尿氨酸酶能够降解KYN并具有降解3-羟基犬尿氨酸或犬尿喹啉酸的活性。在一些实施方案中，该多肽在生理条件下能够降解KYN。例如，多肽可以对至少或约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3,0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、50本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离改性的人犬尿氨酸酶，所述改性酶具有相对天然人犬尿氨酸酶至少一个取代(参见SEQ ID NO:8)，所述至少一个取代包括Met或Leu对Phe的取代，所述取代通常发现于天然人犬尿氨酸酶的第306位上。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.30 US 61/872,132;2014.04.30 US 61/986,3661.一种分离改性的人犬尿氨酸酶，所述改性酶具有相对天然人犬尿氨酸
酶至少一个取代(参见SEQIDNO:8)，所述至少一个取代包括Met或Leu
对Phe的取代，所述取代通常发现于天然人犬尿氨酸酶的第306位上。
2.如权利要求1所述的酶，其中所述至少一个取代包括Phe306Met。
3.如权利要求1所述的酶，其中所述至少一个取代包括Phe306Leu。
4.如权利要求1所述的酶，其进一步包含同种异体肽片段。
5.如权利要求4所述的酶，其中所述同种异体肽片段是XTEN肽、IgG
Fc、白蛋白或白蛋白结合肽。
6.如权利要求1所述的酶，其中所述酶偶联至聚乙二醇(PEG)。
7.如权利要求6所述的酶，其中所述酶通过一个或多个Lys或Cys残基
偶联至PEG。
8.一种包含编码权利要求1所述的酶的核苷酸序列的核酸。
9.如权利要求8所述的核酸，其中所述核酸是被优化用于在细菌、真菌、
昆虫或哺乳动物中表达的密码子。
10.一种包含如权利要求8或9所述的核酸的表达载体。
11.一种包含如权利要求8或9所述的核酸的宿主细胞。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞、真
菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
13.一种药物制剂，其在药学上可接受的载体中包含犬尿氨酸酶或编码
犬尿氨酸酶的核酸的。
14.如权利要求13所述的制剂，其中所述犬尿氨酸酶对犬尿氨酸具有比
对3’-OH犬尿氨酸更大的催化活性。
15.如权利要求13所述的制剂，其中所述犬尿氨酸酶具有至少0.5M-1/s-1的对于犬尿氨酸的kcat/KM。
16.如权利要求13所述的制剂，其中所述犬尿氨酸酶是细菌犬尿氨酸酶。
17.如权利要求16所述的制剂，其中所述细菌犬尿氨酸酶是荧光假单胞
菌犬尿氨酸酶、梭状冻胶样杆菌犬尿氨酸酶或兽类嗜衣原体犬尿氨酸酶。
18.如权利要求16所述的制剂，其中所述细菌犬尿氨酸酶包含与SEQID
NO:7、13-52和57中任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
19.如权利要求13所述的制剂，其中所述犬尿氨酸酶是哺乳动物犬尿氨

\t酸酶。
20.如权利要求19所述的制剂，其中所述哺乳动物犬尿氨酸酶是小鼠或
灵长类动物犬尿氨酸酶。
21.如权利要求20所述的制剂，其中所述灵长类动物犬尿氨酸酶是人犬
尿氨酸酶。
22.如权利要求20所述的制剂，其中所述灵长类动物犬尿氨酸酶包含与
SEQIDNO:8和10-12中任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
23.如权利要求20所述的制剂，其中所述小鼠犬尿氨酸酶包含与SEQID
NO:9具有至少90％同一性的氨基酸序列。
24.如权利要求13所述的制剂，其中所述犬尿氨酸酶是根据权利要求1
所述的犬尿氨酸酶。
25.如权利要求13-24中任一项所述的制剂，其中所述犬尿氨酸酶进一
步包含同种异体肽片段。
26.如权利要求13-24中任一项所述的制剂，其中所述犬尿氨酸酶偶联
至聚乙二醇(PEG)。
27.如权利要求26所述的制剂，其中所述犬尿氨酸酶通过一个或多个
Lys或Cys残基偶联至PEG。
28.如权利要求13所述的制剂，其中编码所述犬尿氨酸酶的所述核酸是
被优化用于在细菌、真菌、昆虫或哺乳动物中表达的密码子。
29.如权利要求13所述的制剂，其中所述核酸在表达载体中。
30.一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，其包括对所述受试者施用有效
量的如权利要求13所述的制剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述受试者已被确定为患有IDO1、
IDO2或TDO表达的肿瘤。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述肿瘤是实体肿瘤。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述肿瘤是血液肿瘤。
34.如权利要求30所述的方法，其中所述受试者是人类患者。
35.如权利要求30所述的方法，其中所述制剂是经瘤内、静脉内、皮内、
动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼
内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、
心包内、脐内、口服、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通
过直接局部灌注浸浴靶细胞、经导管或经灌洗施用。
36.如权利要求30所述的方法，其中将所述制剂施用于所述肿瘤的营养
培养基。
37.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔治·乔治奥，埃弗雷特·斯通，
申请(专利权)人：得克萨斯大学体系董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US