由可再生资源生产化合物的高产路线制造技术

本文提供了制备下列化合物的方法、组合物和非天然存在的微生物有机体，所述化合物例如为1‑丁醇、丁酸、琥珀酸、1,4‑丁二醇、1‑戊醇、戊酸、戊二酸、1,5‑戊二醇、1‑己醇、己酸、己二酸、1,6‑己二醇、6‑羟基己酸、ε‑己内酯、6‑氨基‑己酸、ε‑己内酰胺、六亚甲基二胺、7～25个碳原子长之间的直链脂肪酸和直链脂肪醇、6～24个碳原子长之间的直链烷烃和直链α‑烯烃、癸二酸和十二烷二酸，所述方法包括：a)通过羟醛加成将CN醛和丙酮酸转化为CN+3β‑羟基酮中间体；以及b)通过酶促步骤、或酶促步骤和化学步骤的组合，将CN+3β‑羟基酮中间体转化为所述化合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请基于35U.S.C.§119(e)要求2013年9月17日提交的美国临时专利申请第61/878,996号和2014年2月27日提交的美国临时专利申请第61/945,715号的权益。上述申请均通过引用的方式全部并入本文中。
本公开总体而言涉及组合物，以及制备工业用醇、胺、内酯、内酰胺、酸、7～25个碳原子长之间的直链脂肪酸与直链脂肪醇和6～24个碳原子长之间的直链烷烃与直链α-烯烃的方法。
技术介绍
在本公开中，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过标出引用文献的方式引用，或者通过引用为阿拉伯数字的方式来引用。这些出版物、专利和公开的专利说明书通过引用的方式全部并入本公开中，以更全面的描述本领域的状况。己二酸(ADA)作为广泛使用的化学品，在2012年估计有230万公吨的需求(IHSChemical,ProcessEconomicsProgramReport:Bio-BasedAdipicAcid(HIS化学、工艺经济项目报告：基于生物的己二酸)(Dec.2012))。与六亚甲基二胺(HMDA)一同被用于尼龙6,6、聚酯树脂、增塑剂、食品和其他材料的制造。因此，非常需要使用可再生资源以高产率制备己二酸和HMDA的方法。戊二酸在工业上主要用于生产聚氨酯和聚酯的主要组分1,5-戊二醇。1,6-己二醇是具有末端羟基的直链二醇。其用于工业涂料用途的聚酯，即汽车用途的双组分聚氨酯涂料中。还用于生产大二醇(macrodiol)，例如，用于镶木地板和皮革涂料用弹性体和聚氨酯分散体的己二酸酯和聚碳酸酯二醇。1-丁醇、1-戊醇和1-己醇被广泛地用作工业溶剂。它们也可以脱水制成用于聚乙烯用途的共聚单体1-丁烯、1-戊烯、1-己烯。1-丁醇还是很好的汽油替代品。1-己醇作为芳香剂、工业溶剂、降凝剂和消泡剂而直接用于香料工业(如香精(fragrance))。它也是在化学工业中有价值的中间体。6-氨基-己酸(也被称为6-氨基-羊油酸或ε-氨基-羊油酸)可以通过环化作用而转化为ε-己内酰胺。ε-己内酰胺用于生产在许多不同工业中广泛使用的聚合物尼龙6。因此，更有效的生产ε-己内酰胺前体6-氨基己酸的方法在工业上是重要的。6-羟基己酸可以环化为ε-己内酯，然后可以胺化为ε-己内酰胺。丁酸、戊酸和己酸被广泛用于在工业上制备用于食品、添加剂和塑料工业中的酯。直链脂肪酸(C7～C25)表示仅一个催化步骤与石油衍生的柴油分子不同的一类分子。除了通过酸催化酯化反应而被掺入生物柴油之外，游离脂肪酸可以催化脱羧，产生柴油范畴内的直链烷烃。脂肪酸例如以洗涤剂和肥皂的形式在商业上用作表面活性剂。具有大于16个碳原子的烷烃和α-烯烃是燃油和润滑油的重要成分。可以将在室温下呈固体的较长烷烃用作例如石蜡。较长链烷烃(例如5至16碳)被用作运输燃料(例如汽油、柴油或航空燃料)。直链脂肪醇(C7-C25)主要用于生产洗涤剂和表面活性剂。由于其两亲性的性质，脂肪醇表现为有洗涤剂作用的非离子表面活性剂。直链脂肪二酸癸二酸可以用于增塑剂、润滑剂、液压油、化妆品、蜡烛等。癸二酸也用作芳香剂、防腐剂和涂料的中间体。十二烷二酸用于制造粘合剂、润滑剂、聚酰胺纤维、树脂、聚酯涂料和增塑剂。因此，更有效的生产这些化学品的方法在工业上是重要的。
技术实现思路
本文公开了使用可再生资源以高产量制备下列化合物的新的方法、组合物和非天然存在的微生物有机体，所述化合物为1-丁醇、丁酸、琥珀酸、1,4-丁二醇、1-戊醇、戊酸、戊二酸、1,5-戊二醇、1-己醇、己酸、己二酸、1,6-己二醇、6-羟基己酸、ε-己内酯、6-氨基-己酸、ε-己内酰胺、六亚甲基二胺、7～25个碳原子长之间的直链脂肪酸和直链脂肪醇、6～24个碳原子长之间的直链烷烃和直链α-烯烃、癸二酸以及十二烷二酸。在一个方面，本公开提供了制备式I、II、III或IV的化合物或其盐、或者该化合物或其盐的溶剂化物的方法，该方法包括酶促步骤或酶促与化学步骤的组合，R1-(CH2)s-R2(I)，R3-(CH2)t-CH3(IV)，其中，R1为CH2OH、CH2NH2或CO2H，R2为CH3、CH2OH、CH2NH2或CO2H，R3为CH2CH3或CH＝CH2、r为4；s为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23，t为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21。在一些方面，所述方法包括以下或基本由以下组成、还或者由以下组成：在下述条件下，在溶液中组合或温育CN醛和丙酮酸(pyruvate)，所述条件为：(a)通过羟醛加成(aldoladdition)将该CN醛和该丙酮酸转化为CN+3β-羟基酮中间体；然后(b)通过酶促步骤或酶促与化学步骤的组合，将CN+3β-羟基酮中间体转化为式I、II、III或IV的化合物或其盐、或者该化合物或其盐的溶剂化物。在一些方面，N为s-1或N＝t+1或N＝r-1，其中，N为1-22，优选N为1-6，s为2-23，优选s为2-7，t为2-21，优选t是9-19。在某些方面，若s＝3，则N＝s。在一些方面，N不等于s。在一些方面，本公开提供了制备下列化合物、或其混合物、或其盐、或者该化合物或其盐的溶剂化物的方法，所述化合物选自1-丁醇、丁酸、琥珀酸、1,4-丁二醇、1-戊醇、戊酸、戊二酸、1,5-戊二醇、1-己醇、己酸、己二酸、1,6-己二醇、6-羟基己酸、ε-己内酯、6-氨基-己酸、ε-己内酰胺、六亚甲基二胺、7～25个碳原子长之间的直链脂肪酸和直链脂肪醇、6～24个碳原子长之间的直链烷烃和直链α-烯烃、癸二酸或十二烷二酸，所述方法包括以下或基本由以下组成、还或者由以下组成：(a)通过羟醛加成将CN醛和丙酮酸转化为CN+3β-羟基酮中间体；以及(b)通过酶促步骤或酶促与化学步骤的组合，将CN+3β-羟基酮中间体转化为该化合物，其中，N为M-3，其中，M为所制备的化合物中的碳原子数，N为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22。在上述方法的一个方面，所述微生物用作制备下列化合物或其盐、或者该化合物或其盐的溶剂化物的宿主，所述化合物为式I、II、III或IV的化合物，或者选自1-丁醇、丁酸、琥珀酸、1,4-丁二醇、1-戊醇、戊酸、戊二酸、1,5-戊二醇、1-己醇、己酸、己二酸、1,6-己...

【技术保护点】
一种非天然存在的微生物有机体，包括至少一种编码来自于下列酶组的酶的外源核酸，所述酶组为己二酸途径酶、6‑氨基己酸途径酶、ε‑己内酰胺途径酶、6‑羟基己酸途径酶、己内酯途径酶、1,6‑己二醇途径酶、HMDA途径酶、1‑己醇途径酶或3‑氧代‑丙酸途径酶的组。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.17 US 61/878,996;2014.02.27 US 61/945,7151.一种非天然存在的微生物有机体，包括至少一种编码来自于下列酶组的酶的外源核
酸，所述酶组为己二酸途径酶、6-氨基己酸途径酶、ε-己内酰胺途径酶、6-羟基己酸途径酶、
己内酯途径酶、1,6-己二醇途径酶、HMDA途径酶、1-己醇途径酶或3-氧代-丙酸途径酶的组。
2.一种微生物有机体，包括选自2A的至少一种酶，其中，2A为4-羟基-2-氧代-己二酸醛
缩酶、4,6-二羟基-2-氧代-己酸醛缩酶或6-氨基-4-羟基-2-氧代-己酸醛缩酶。
3.一种非天然存在的微生物有机体，包括至少一种编码选自2A、以及2B、3B1、3B2中的
一种以上的己二酸途径酶的外源核酸，其中，2A为4-羟基-2-氧代-己二酸醛缩酶、4,6-二羟
基-2-氧代-己酸醛缩酶或6-氨基-4-羟基-2-氧代-己酸醛缩酶，2B为4-羟基-2-氧代-己二
酸脱水酶、4,6-二羟基-2-氧代-己酸4-脱水酶或6-氨基-4-羟基-2-氧代-己酸脱水酶，3B1
为4-羟基-2-氧代-己二酸2-还原酶、4,6-二羟基-2-氧代-己酸2-还原酶或6-氨基-4-羟基-
2-氧代-己酸2-还原酶，并且3B2为4-羟基-2-氧代-己二酸4-脱氢酶、4,6-二羟基-2-氧代-
己酸4-脱氢酶或6-氨基-4-羟基-2-氧代-己酸4-脱氢酶。
4.根据权利要求3所述的有机体，进一步包括选自2C、3G1、3C2、3C3中的一种以上的己
二酸途径酶，其中，2C为3,4-脱氢-2-氧代-己二酸3-还原酶、6-羟基-3,4-脱氢-2-氧代己酸
3-还原酶或6-氨基-3,4-脱氢-2-氧代己酸3-还原酶，3G1为2,4-二羟基己二酸CoA-转移酶
或2,4-二羟基己二酸-CoA连接酶、2,4,6-三羟基己酸CoA-转移酶或2,4,6-三羟基己酸-CoA
连接酶、或者6-氨基-2,4-二羟基己酸CoA-转移酶或6-氨基-2,4-二羟基己酸-CoA连接酶，
3C2为2,4-二羟基己二酸4-脱氢酶、2,4,6-三羟基己酸4-脱氢酶或6-氨基-2,4-二羟基己酸
4-脱氢酶，并且3C3为2,4-二氧代己二酸2-还原酶、6-羟基-2,4-二氧代己酸2-还原酶或6-
氨基-2,4-二氧代己酸2-还原酶。
5.根据权利要求4所述的有机体，进一步包括2J、2G、3E1、3E2、4E3、4E4、3K2、3K1、4F4、
3N、2D、3L2、3L1、3F2、3F1、4A1、4A2、4A3、4A4、4A5、3C1、4B1、4B4、4B5、4B6、4B7、4F1、4F2、
4F3、4F5、2E、3G2、3G5、2I、3M、3H、2F、3D3、3D2、3D1、4D3、4D4、4D5、4G1、4G2、4G3、4G4和4G5中
的一种以上、或者两种以上、或者三种以上、或者四种以上、或者五种以上、或者六种以上、
或者七种以上、或者八种以上、或者九种以上，其中，2J为4,5-脱氢-2-羟基-己二酰-CoA4,
5-还原酶，2G为2,3-脱氢-己二酰-CoA2,3-还原酶、6-羟基-2,3-脱氢-己酰-CoA2,3-还原
酶或6-氨基-2,3-脱氢-己酰-CoA2,3-还原酶，3E1为2,3-脱氢-4-氧代己二酰-CoA2,3-还
原酶、6-羟基-2,3-脱氢-4-氧代己酰-CoA2,3-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-氧代己酰-
CoA2,3-还原酶，3E2为2,3-脱氢-4-氧代己二酸2,3-还原酶、6-羟基-2,3-脱氢-4-氧代己
酸2,3-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-氧代己酸2,3-还原酶，4E3为4,5-脱氢己二酰-CoA4,
5-还原酶，4E4为4,5-脱氢-6-氧代己酰-CoA4,5-还原酶，3K2为2,3-脱氢-4-羟基己二酸2,
3-还原酶、4,6-二羟基-2,3-脱氢己酸2,3-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-羟基己酸2,3-还
原酶，3K1为2,3-脱氢-4-羟基己二酰-CoA2,3-还原酶、4,6-二羟基-2,3-脱氢己酰-CoA2,
3-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-羟基己酰-CoA2,3-还原酶，4F4为4,5-脱氢-6-氧代己酸
4,5-还原酶，3N为2-氧代己二酰-CoA2-还原酶、6-羟基-2-氧代己酰-CoA2-还原酶或6-氨
基-2-氧代己酰-CoA2-还原酶，2D为2-氧代己二酸2-还原酶、6-羟基-2氧代己酸2-还原酶
或6-氨基-2-氧代己酸2-还原酶，3L2为2,3-脱氢-4-氧代己二酸4-还原酶、6-羟基-2,3-脱
氢-4-氧代己酸4-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-氧代己酸4-还原酶，3L1为2,3-脱氢-4-氧
代己二酰-CoA4-还原酶、6-羟基-2,3-脱氢-4-氧代己酰-CoA4-还原酶或6-氨基-2,3-脱
氢-4-氧代己酰-CoA4-还原酶，3F2为4-氧代己二酸4-还原酶、6-羟基-4-氧代己酸4-还原
酶或6-氨基-4-氧代己酸4-还原酶，3F1为4-氧代己二酰-CoA3-还原酶、6-羟基-4-氧代己
酰-CoA4-还原酶或6-氨基-4-氧代己酰-CoA4-还原酶，4A1为4,6-二羟基-2,3-脱氢己酰-
CoA6-脱氢酶，4A2为4,6-二羟基己酰-CoA6-脱氢酶，4A3为6-羟基己酰-CoA6-脱氢酶，
4A4为6-羟基己酸6-脱氢酶，4A5为4,6-二羟基己酸6-脱氢酶，3C1为2,4-二羟基己二酰-CoA
4-脱氢酶、2,4,6-三羟基己酰-CoA4-脱氢酶或6-氨基-2,4-二羟基己酰-CoA4-脱氢酶，4B1
为4-羟基-2,3-脱氢-6-氧代己酰-CoA6-脱氢酶，4B4为4-羟基-6-氧代己酰-CoA6-脱氢
酶，4B5为4,5-脱氢-6-氧代己酰-CoA6-脱氢酶，4B6为6-氧代己酰-CoA6-脱氢酶，4B7为6-
氧代己酸6-脱氢酶，4F1为己二酰-CoA转移酶、己二酰-CoA水解酶或己二酰-CoA连接酶，4F2
为6-氧代己酰-CoA转移酶、6-氧代己酰-CoA水解酶或6-氧代己酰-CoA连接酶，4F3为6-羟基
己酰-CoA转移酶、6-羟基己酰-CoA水解酶或6-羟基己酰-CoA连接酶，4F5为6-氨基己酰-CoA
转移酶、6-氨基己酰-CoA水解酶或6-氨基己酰-CoA连接酶，2E为2-羟基-己二酸CoA-转移酶
或2-羟基己二酸-CoA连接酶、2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶或2,6-二羟基-己酸-CoA连接
酶、6-氨基-2-羟基己酸CoA-转移酶或6-氨基-2-羟基己酸-CoA连接酶，3G2为2-羟基-4氧代
己二酸CoA-转移酶或2-羟基-4氧代己二酸-CoA连接酶、2,6-二羟基-4氧代己酸CoA–转移酶
或2,6-二羟基-4氧代己酸-CoA连接酶、或6-氨基-2-羟基-4氧代己酸CoA–转移酶或6-氨基-
2-羟基-4氧代己酸-CoA连接酶，3G5为4-羟基己二酸CoA-转移酶或4-羟基己二酸-CoA连接
酶、4,6-二羟基己酸CoA-转移酶或4,6-二羟基己酸-CoA连接酶、或6-氨基-4-羟基己酸CoA-
转移酶或6-氨基-4-羟基己酸-CoA连接酶，2I为2,4-二羟基己二酰-CoA4-脱水酶(4,5-脱
氢型)，3M为2,4-二羟基己二酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)、2,4,6-三羟基己酰-CoA4-脱
水酶(2,3-脱氢型)、或6-氨基-2,4-二羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)，3H为4-羟基
己二酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)、4,6-二羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)或6-氨
基-4-羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)，2F为2-羟基-己二酰-CoA2-脱水酶、2,6-二
羟基-己酰-CoA2-脱水酶或6-氨基-2-羟基-己酰-CoA2-脱水酶，3D3为2,4-二羟基己二
酰-CoA2-脱水酶、2,4,6-三羟基己酰-CoA2-脱水酶或6-氨基-2,4-二羟基己酰-CoA2-脱
水酶，3D2为2-羟基-4氧代己二酸2-脱水酶、2,6-二羟基-4氧代己酸2-脱水酶或6-氨基-2-
羟基-4氧代己酸2-脱水酶，3D1为2-羟基-4氧代己二酰-CoA2-脱水酶、2,6-二羟基-4氧代
己酰-CoA2-脱水酶或6-氨基-2-羟基-4氧代己酰-CoA2-脱水酶，4D3为4-羟基-己二酰-
CoA4-脱水酶(4,5-脱氢型)，4D4为4-羟基-6氧代己酰-CoA4-脱水酶(4,5-脱氢型)，4D5为
4-羟基-6氧代己酸4-脱水酶(4,5-脱氢型)，4G1为6-氨基己酰-CoA转氨酶或6-氨基己酰-
CoA脱氢酶(脱氨基)，4G2为6-氨基己酸转氨酶或6-氨基己酸脱氢酶(脱氨基)，4G3为6-氨
基-4-羟基己酰-CoA转氨酶或6-氨基-4-羟基己酰-CoA脱氢酶(脱氨基)，4G4为6-氨基-4-羟
基-2,3-脱氢己酰-CoA转氨酶或6-氨基-4-羟基-2,3-脱氢己酰-CoA脱氢酶(脱氨基)，并且
4G5为6-氨基-4-羟基己酸转氨酶或6-氨基-4-羟基己酸脱氢酶(脱氨基)。
6.一种非天然存在的微生物有机体，包括一种以上编码己二酸途径中的2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11或12种酶的外源核酸。
7.一种生产己二酸的方法，包括在含有甘油或者C5或C6糖、或者它们的组合的培养物
中培养根据权利要求3～6中任一项所述的非天然存在的微生物有机体，以及可选地，从有
机体或含有有机体的培养物中分离由有机体产生的己二酸。
8.一种非天然存在的微生物有机体，包括至少一种编码选自2A、以及2B、3B1、3B2中的
一种以上的6-氨基己酸途径酶的外源核酸，其中，2A为4-羟基-2-氧代-己二酸醛缩酶、4,6-
二羟基-2-氧代-己酸醛缩酶或6-氨基-4-羟基-2-氧代-己酸醛缩酶，2B为4-羟基-2-氧代-
己二酸脱水酶、4,6-二羟基-2-氧代-己酸4-脱水酶或6-氨基-4-羟基-2-氧代-己酸脱水酶，
3B1为4-羟基-2-氧代-己二酸2-还原酶、4,6-二羟基-2-氧代-己酸2-还原酶或6-氨基-4-羟
基-2-氧代-己酸2-还原酶，并且3B2为4-羟基-2-氧代-己二酸4-脱氢酶、4,6-二羟基-2-氧
代-己酸4-脱氢酶或6-氨基-4-羟基-2-氧代-己酸4-脱氢酶。
9.根据权利要求8所述的有机体，进一步包括2C、3G1、3C2、3C3中的一种以上，其中，2C
为3,4-脱氢-2-氧代-己二酸3-还原酶、6-羟基-3,4-脱氢-2-氧代己酸3-还原酶或6-氨基-
3,4-脱氢-2-氧代己酸3-还原酶，3G1为2,4-二羟基己二酸CoA-转移酶或2,4-二羟基己二
酸-CoA连接酶、2,4,6-三羟基己酸CoA-转移酶或2,4,6-三羟基己酸-CoA连接酶、或者6-氨
基-2,4-二羟基己酸CoA-转移酶或6-氨基-2,4-二羟基己酸-CoA连接酶，3C2为2,4-二羟基
己二酸4-脱氢酶、2,4,6-三羟基己酸4-脱氢酶或6-氨基-2,4-二羟基己酸4-脱氢酶，并且
3C3为2,4-二氧代己二酸2-还原酶、6-羟基-2,4-二氧代己酸2-还原酶或6-氨基-2,4-二氧
代己酸2-还原酶。
10.根据权利要求9所述的有机体，进一步包括2J、2G、3E1、3E2、4E3、4E4、3K2、3K1、4F4、
3N、2D、3L2、3L1、3F2、3F1、4A1、4A2、4A3、4A4、4A5、3C1、4B1、4B4、4B5、4F2、4F3、4F5、2E、3G2、
3G5、2I、3M、3H、2F、3D3、3D2、3D1、4D3、4D4、4D5、5J、5I和5G中的一种以上、或者两种以上、或
者三种以上、或者四种以上、或者五种以上、或者六种以上、或者七种以上、或者八种以上、
或者九种以上、或者十种以上、或者十一种以上,其中，2J为4,5-脱氢-2-羟基-己二酰-CoA
4,5-还原酶，2G为2,3-脱氢-己二酰-CoA2,3-还原酶、6-羟基-2,3-脱氢-己酰-CoA2,3-还
原酶或6-氨基-2,3-脱氢-己酰-CoA2,3-还原酶，3E1为2,3-脱氢-4-氧代己二酰-CoA2,3-
还原酶、6-羟基-2,3-脱氢-4-氧代己酰-CoA2,3-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-氧代己酰-
CoA2,3-还原酶，3E2为2,3-脱氢-4-氧代己二酸2,3-还原酶、6-羟基-2,3-脱氢-4-氧代己
酸2,3-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-氧代己酸2,3-还原酶，4E3为4,5-脱氢己二酰-CoA4,
5-还原酶，4E4为4,5-脱氢-6-氧代己酰-CoA4,5-还原酶，3K2为2,3-脱氢-4-羟基己二酸2,
3-还原酶、4,6-二羟基-2,3-脱氢己酸2,3-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-羟基己酸2,3-还
原酶，3K1为2,3-脱氢-4-羟基己二酰-CoA2,3-还原酶、4,6-二羟基-2,3-脱氢己酰-CoA2,
3-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-羟基己酰-CoA2,3-还原酶，4F4为4,5-脱氢-6-氧代己酸
4,5-还原酶，3N为2-氧代己二酰-CoA2-还原酶、6-羟基-2-氧代己酰-CoA2-还原酶或6-氨
基-2-氧代己酰-CoA2-还原酶，2D为2-氧代己二酸2-还原酶、6-羟基-2氧代己酸2-还原酶或
6-氨基-2-氧代己酸2-还原酶，3L2为2,3-脱氢-4-氧代己二酸4-还原酶、6-羟基-2,3-脱氢-
4-氧代己酸4-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-氧代己酸4-还原酶，3L1为2,3-脱氢-4-氧代己
二酰-CoA4-还原酶、6-羟基-2,3-脱氢-4-氧代己酰-CoA4-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-
氧代己酰-CoA4-还原酶，3F2为4-氧代己二酸4-还原酶、6-羟基-4-氧代己酸4-还原酶或6-
氨基-4-氧代己酸4-还原酶，3F1为4-氧代己二酰-CoA3-还原酶、6-羟基-4-氧代己酰-CoA
4-还原酶或6-氨基-4-氧代己酰-CoA4-还原酶，4A1为4,6-二羟基-2,3-脱氢己酰-CoA6-
脱氢酶，4A2为4,6-二羟基己酰-CoA6-脱氢酶，4A3为6-羟基己酰-CoA6-脱氢酶，4A4为6-
羟基己酸6-脱氢酶，4A5为4,6-二羟基己酸6-脱氢酶，3C1为2,4-二羟基己二酰-CoA4-脱氢
酶、2,4,6-三羟基己酰-CoA4-脱氢酶或6-氨基-2,4-二羟基己酰-CoA4-脱氢酶，4B1为4-
羟基-2,3-脱氢-6-氧代己酰-CoA6-脱氢酶，4B4为4-羟基-6-氧代己酰-CoA6-脱氢酶，4B5
为4,5-脱氢-6-氧代己酰-CoA6-脱氢酶，4F2为6-氧代己酰-CoA转移酶、6-氧代己酰-CoA水
解酶或6-氧代己酰-CoA连接酶，4F3为6-羟基己酰-CoA转移酶、6-羟基己酰-CoA水解酶或6-
羟基己酰-CoA连接酶，4F5为6-氨基己酰-CoA转移酶、6-氨基己酰-CoA水解酶或6-氨基己
酰-CoA连接酶，2E为2-羟基-己二酸CoA-转移酶或2-羟基己二酸-CoA连接酶，2,6-二羟基-
己酸CoA-转移酶或2,6-二羟基-己酸-CoA连接酶，6-氨基-2-羟基己酸CoA-转移酶或6-氨
基-2-羟基己酸-CoA连接酶，3G2为2-羟基-4氧代己二酸CoA-转移酶或2-羟基-4氧代己二
酸-CoA连接酶、2,6-二羟基-4氧代己酸CoA–转移酶或2,6-二羟基-4氧代己酸-CoA连接酶、
或6-氨基-2-羟基-4氧代己酸CoA–转移酶或6-氨基-2-羟基-4氧代己酸-CoA连接酶，3G5为
4-羟基己二酸CoA-转移酶或4-羟基己二酸-CoA连接酶、4,6-二羟基己酸CoA-转移酶或4,6-
二羟基己酸-CoA连接酶、或6-氨基-4-羟基己酸CoA-转移酶或6-氨基-4-羟基己酸-CoA连接
酶，2I为2,4-二羟基己二酰-CoA4-脱水酶(4,5-脱氢型)，3M为2,4-二羟基己二酰-CoA4-
脱水酶(2,3-脱氢型)、2,4,6-三羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)、或6-氨基-2,4-二
羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)，3H为4-羟基己二酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)、
4,6-二羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)或6-氨基-4-羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-
脱氢型)，2F为2-羟基-己二酰-CoA2-脱水酶、2,6-二羟基-己酰-CoA2-脱水酶或6-氨基-
2-羟基-己酰-CoA2-脱水酶，3D3为2,4-二羟基己二酰-CoA2-脱水酶、2,4,6-三羟基己酰-
CoA2-脱水酶或6-氨基-2,4-二羟基己酰-CoA2-脱水酶，3D2为2-羟基-4氧代己二酸2-脱
水酶、2,6-二羟基-4氧代己酸2-脱水酶或6-氨基-2-羟基-4氧代己酸2-脱水酶，3D1为2-羟
基-4氧代己二酰-CoA2-脱水酶、2,6-二羟基-4氧代己酰-CoA2-脱水酶或6-氨基-2-羟基-
4氧代己酰-CoA2-脱水酶，4D3为4-羟基-己二酰-CoA4-脱水酶(4,5-脱氢型)，4D4为4-羟
基-6氧代己酰-CoA4-脱水酶(4,5-脱氢型)，4D54-羟基-6氧代己酸4-脱水酶(4,5-脱氢
型),5J为6-氧代己酸转氨酶(胺化)或6-氧代己酸脱氢酶(胺化)，5I为6-氧代己酰-CoA转氨
酶(胺化)、或6-氧代己酰-CoA脱氢酶(胺化)，并且5G为己二酰-CoA1-还原酶。
11.一种非天然存在的微生物有机体，包括一种以上编码6-氨基己酸途径中的2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11或12种酶的外源核酸。
12.一种生产6-氨基己酸的方法，包括在含有甘油或者C5或C6糖、或者它们的组合的培
养物中培养根据权利要求8～11中任一项所述的非天然存在的微生物有机体，以及可选地，
从有机体或含有有机体的培养物中分离由有机体产生的6-氨基己酸。
13.一种非天然存在的微生物有机体，包括至少一种编码选自2A、以及2B、3B1、3B2中的
一种以上的己内酰胺途径酶的外源核酸，其中，2A为4-羟基-2-氧代-己二酸醛缩酶、4,6-二
羟基-2-氧代-己酸醛缩酶或6-氨基-4-羟基-2-氧代-己酸醛缩酶，2B为4-羟基-2-氧代-己
二酸脱水酶、4,6-二羟基-2-氧代-己酸4-脱水酶或6-氨基-4-羟基-2-氧代-己酸脱水酶，
3B1为4-羟基-2-氧代-己二酸2-还原酶、4,6-二羟基-2-氧代-己酸2-还原酶或6-氨基-4-羟
基-2-氧代-己酸2-还原酶，并且3B2为4-羟基-2-氧代-己二酸4-脱氢酶、4,6-二羟基-2-氧
代-己酸4-脱氢酶或6-氨基-4-羟基-2-氧代-己酸4-脱氢酶。
14.根据权利要求13所述的有机体，进一步包括选自2C、3G1、3C2、3C3中的一种以上的
ε-己内酰胺途径酶，其中，2C为3,4-脱氢-2-氧代-己二酸3-还原酶、6-羟基-3,4-脱氢-2-氧
代己酸3-还原酶或6-氨基-3,4-脱氢-2-氧代己酸3-还原酶，3G1为2,4-二羟基己二酸CoA-
转移酶或2,4-二羟基己二酸-CoA连接酶、2,4,6-三羟基己酸CoA-转移酶或2,4,6-三羟基己
酸-CoA连接酶、或者6-氨基-2,4-二羟基己酸CoA-转移酶或6-氨基-2,4-二羟基己酸-CoA连
接酶，3C2为2,4-二羟基己二酸4-脱氢酶、2,4,6-三羟基己酸4-脱氢酶或6-氨基-2,4-二羟
基己酸4-脱氢酶，并且3C3为2,4-二氧代己二酸2-还原酶、6-羟基-2,4-二氧代己酸2-还原
酶或6-氨基-2,4-二氧代己酸2-还原酶。
15.根据权利要求14所述的有机体，进一步包括2J、2G、3E1、3E2、4E3、4E4、3K2、3K1、
4F4、3N、2D、3L2、3L1、3F2、3F1、4A1、4A2、4A3、4A4、4A5、3C1、4B1、4B4、4B5、4F2、4F3、2E、3G2、
3G5、2I、3M、3H、2F、3D3、3D2、3D1、4D3、4D4、4D5、5J、5I、5G、5A、5C中的一种以上、或者两种以
上、或者三种以上、或者四种以上、或者五种以上、或者六种以上、或者七种以上、或者八种
以上、或者九种以上、或者十种以上、或者十一种以上、或者十二种以上，其中，2J为4,5-脱
氢-2-羟基-己二酰-CoA4,5-还原酶，2G为2,3-脱氢-己二酰-CoA2,3-还原酶、6-羟基-2,
3-脱氢-己酰-CoA2,3-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-己酰-CoA2,3-还原酶，3E1为2,3-脱
氢-4-氧代己二酰-CoA2,3-还原酶、6-羟基-2,3-脱氢-4-氧代己酰-CoA2,3-还原酶或6-
氨基-2,3-脱氢-4-氧代己酰-CoA2,3-还原酶，3E2为2,3-脱氢-4-氧代己二酸2,3-还原酶、
6-羟基-2,3-脱氢-4-氧代己酸2,3-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-氧代己酸2,3-还原酶，
4E3为4,5-脱氢己二酰-CoA4,5-还原酶，4E4为4,5-脱氢-6-氧代己酰-CoA4,5-还原酶，3K2
为2,3-脱氢-4-羟基己二酸2,3-还原酶、4,6-二羟基-2,3-脱氢己酸2,3-还原酶或6-氨基-
2,3-脱氢-4-羟基己酸2,3-还原酶，3K1为2,3-脱氢-4-羟基己二酰-CoA2,3-还原酶、4,6-
二羟基-2,3-脱氢己酰-CoA2,3-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-羟基己酰-CoA2,3-还原
酶，4F4为4,5-脱氢-6-氧代己酸4,5-还原酶，3N为2-氧代己二酰-CoA2-还原酶、6-羟基-2-
氧代己酰-CoA2-还原酶或6-氨基-2-氧代己酰-CoA2-还原酶，2D为2-氧代己二酸2-还原
酶、6-羟基-2氧代己酸2-还原酶或6-氨基-2-氧代己酸2-还原酶，3L2为2,3-脱氢-4-氧代己
二酸4-还原酶、6-羟基-2,3-脱氢-4-氧代己酸4-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-氧代己酸4-
还原酶，3L1为2,3-脱氢-4-氧代己二酰-CoA4-还原酶、6-羟基-2,3-脱氢-4-氧代己酰-CoA
4-还原酶或6-氨基-2,3-脱氢-4-氧代己酰-CoA4-还原酶，3F2为4-氧代己二酸4-还原酶、
6-羟基-4-氧代己酸4-还原酶或6-氨基-4-氧代己酸4-还原酶，3F1为4-氧代己二酰-CoA3-
还原酶、6-羟基-4-氧代己酰-CoA4-还原酶或6-氨基-4-氧代己酰-CoA4-还原酶，4A1为4,
6-二羟基-2,3-脱氢己酰-CoA6-脱氢酶，4A2为4,6-二羟基己酰-CoA6-脱氢酶，4A3为6-羟
基己酰-CoA6-脱氢酶，4A4为6-羟基己酸6-脱氢酶，4A5为4,6-二羟基己酸6-脱氢酶，3C1为
2,4-二羟基己二酰-CoA4-脱氢酶、2,4,6-三羟基己酰-CoA4-脱氢酶或6-氨基-2,4-二羟基
己酰-CoA4-脱氢酶，4B1为4-羟基-2,3-脱氢-6-氧代己酰-CoA6-脱氢酶，4B4为4-羟基-6-
氧代己酰-CoA6-脱氢酶，4B5为4,5-脱氢-6-氧代己酰-CoA6-脱氢酶，4F2为6-氧代己酰-
CoA转移酶、6-氧代己酰-CoA水解酶或6-氧代己酰-CoA连接酶，4F3为6-羟基己酰-CoA转移
酶、6-羟基己酰-CoA水解酶或6-羟基己酰-CoA连接酶、6-氨基己酰-CoA水解酶或6-氨基己
酰-CoA连接酶，2E为2-羟基-己二酸CoA-转移酶或2-羟基己二酸-CoA连接酶，2,6-二羟基-
己酸CoA-转移酶或2,6-二羟基-己酸-CoA连接酶，6-氨基-2-羟基己酸CoA-转移酶或6-氨
基-2-羟基己酸-CoA连接酶，3G2为2-羟基-4氧代己二酸CoA-转移酶或2-羟基-4氧代己二
酸-CoA连接酶、2,6-二羟基-4氧代己酸CoA–转移酶或2,6-二羟基-4氧代己酸-CoA连接酶、
或6-氨基-2-羟基-4氧代己酸CoA–转移酶或6-氨基-2-羟基-4氧代己酸-CoA连接酶，3G5为
4-羟基己二酸CoA-转移酶或4-羟基己二酸-CoA连接酶、4,6-二羟基己酸CoA-转移酶或4,6-
二羟基己酸-CoA连接酶、或6-氨基-4-羟基己酸CoA-转移酶或6-氨基-4-羟基己酸-CoA连接
酶，2I为2,4-二羟基己二酰-CoA4-脱水酶(4,5-脱氢型)，3M为2,4-二羟基己二酰-CoA4-
脱水酶(2,3-脱氢型)、2,4,6-三羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)、或6-氨基-2,4-二
羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)，3H为4-羟基己二酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)、
4,6-二羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)或6-氨基-4-羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-
脱氢型)，2F为2-羟基-己二酰-CoA2-脱水酶、2,6-二羟基-己酰-CoA2-脱水酶或6-氨基-
2-羟基-己酰-CoA2-脱水酶，3D3为2,4-二羟基己二酰-CoA2-脱水酶、2,4,6-三羟基己酰-
CoA2-脱水酶或6-氨基-2,4-二羟基己酰-CoA2-脱水酶，3D2为2-羟基-4氧代己二酸2-脱
水酶、2,6-二羟基-4氧代己酸2-脱水酶或6-氨基-2-羟基-4氧代己酸2-脱水酶，3D1为2-羟
基-4氧代己二酰-CoA2-脱水酶、2,6-二羟基-4氧代己酰-CoA2-脱水酶或6-氨基-2-羟基-
4氧代己酰-CoA2-脱水酶，4D3为4-羟基-己二酰-CoA4-脱水酶(4,5-脱氢型)，4D4为4-羟
基-6氧代己酰-CoA4-脱水酶(4,5-脱氢型)，4D54-羟基-6氧代己酸4-脱水酶(4,5-脱氢
型)，5J为6-氧代己酸转氨酶(胺化)或6-氧代己酸脱氢酶(胺化)，5I为6-氧代己酰-CoA转氨
酶(胺化)、或6-氧代己酰-CoA脱氢酶(胺化)，5G为己二酰-CoA1-还原酶，5C为6-氨基己酸
CoA-转移酶或6-氨基己酸-CoA连接酶，并且5A为自发环化作用或酰胺水解酶。
16.一种非天然存在的微生物有机体，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种均编码
己内酰胺途径酶的外源核酸。
17.一种生产己内酰胺的方法，包括在含有甘油或者C5或C6糖、或者它们的组合的培养
物中培养权利要求13～16中任一项所述的非天然存在的微生物有机体，以及可选地，从有
机体或含有有机体的培养物中分离由有机体产生的己内酰胺。
18.一种非天然存在的微生物有机体，包括至少一种编码选自2A、以及2B、3B1、3B2中的
一种以上的6-羟基己酸途径酶的外源核酸，其中，2A为4-羟基-2-氧代-己二酸醛缩酶或4,
6-二羟基-2-氧代-己酸醛缩酶，2B为4-羟基-2-氧代-己二酸脱水酶或4,6-二羟基-2-氧代-
己酸4-脱水酶，3B1为4-羟基-2-氧代-己二酸2-还原酶或4,6-二羟基-2-氧代-己酸2-还原
酶，并且3B2为4-羟基-2-氧代-己二酸4-脱氢酶或4,6-二羟基-2-氧代-己酸4-脱氢酶。
19.根据权利要求18所述的有机体，进一步包括选自2C、3G1、3C2、3C3中的一种以上的
6-羟基己酸途径酶，其中，2C为3,4-脱氢-2-氧代-己二酸3-还原酶或6-羟基-3,4-脱氢-2-
氧代己酸3-还原酶，3G1为2,4-二羟基己二酸CoA-转移酶或2,4-二羟基己二酸-CoA连接酶、
或者2,4,6-三羟基己酸CoA-转移酶或2,4,6-三羟基己酸-CoA连接酶，3C2为2,4-二羟基己
二酸4-脱氢酶或2,4,6-三羟基己酸4-脱氢酶，并且3C3为2,4-二氧代己二酸2-还原酶或6-
羟基-2,4-二氧代己酸2-还原酶。
20.根据权利要求19所述的有机体，进一步包括2J、2G、3E1、3E2、4E3、4E4、3K2、3K1、
4F4、3N、2D、3L2、3L1、3F2、3F1、4A1、4A2、4A3、4A5、3C1、4B1、4B4、4B5、4F2、4F3、2E、3G2、3G5、
2I、3M、3H、2F、3D3、3D2、3D1、4D3、4D4、4D5、5G、5L和5K中的一种以上、或者两种以上、或者三
种以上、或者四种以上、或者五种以上、或者六种以上、或者七种以上、或者八种以上、或者
九种以上、或者十种以上、或者十一种以上、或者十二种以上，其中，2J为4,5-脱氢-2-羟基-
己二酰-CoA4,5-还原酶，2G为2,3-脱氢-己二酰-CoA2,3-还原酶或6-羟基-2,3-脱氢-己
酰-CoA2,3-还原酶，3E1为2,3-脱氢-4-氧代己二酰-CoA2,3-还原酶或6-羟基-2,3-脱氢-
4-氧代己酰-CoA2,3-还原酶，3E2为2,3-脱氢-4-氧代己二酸2,3-还原酶或6-羟基-2,3-脱
氢-4-氧代己酸2,3-还原酶，4E3为4,5-脱氢己二酰-CoA4,5-还原酶，4E4为4,5-脱氢-6-氧
代己酰-CoA4,5-还原酶，3K2为2,3-脱氢-4-羟基己二酸2,3-还原酶或4,6-二羟基-2,3-脱
氢己酸2,3-还原酶，3K1为2,3-脱氢-4-羟基己二酰-CoA2,3-还原酶或4,6-二羟基-2,3-脱
氢己酰-CoA2,3-还原酶，4F4为4,5-脱氢-6-氧代己酸4,5-还原酶，3N为2-氧代己二酰-CoA
2-还原酶或6-羟基-2-氧代己酰-CoA2-还原酶，2D为2-氧代己二酸2-还原酶或6-羟基-2氧
代己酸2-还原酶，3L2为2,3-脱氢-4-氧代己二酸4-还原酶或6-羟基-2,3-脱氢-4-氧代己酸
4-还原酶，3L1为2,3-脱氢-4-氧代己二酰-CoA4-还原酶或6-羟基-2,3-脱氢-4-氧代己酰-
CoA4-还原酶，3F2为4-氧代己二酸4-还原酶或6-羟基-4-氧代己酸4-还原酶，3F1为4-氧代
己二酰-CoA3-还原酶或6-羟基-4-氧代己酰-CoA4-还原酶，4A1为4,6-二羟基-2,3-脱氢
己酰-CoA6-脱氢酶，4A2为4,6-二羟基己酰-CoA6-脱氢酶，4A4为6-羟基己酸6-脱氢酶，
4A5为4,6-二羟基己酸6-脱氢酶，3C1为2,4-二羟基己二酰-CoA4-脱氢酶或2,4,6-三羟基
己酰-CoA4-脱氢酶，4B1为4-羟基-2,3-脱氢-6-氧代己酰-CoA6-脱氢酶，4B4为4-羟基-6-
氧代己酰-CoA6-脱氢酶，4B5为4,5-脱氢-6-氧代己酰-CoA6-脱氢酶，4F2为6-氧代己酰-
CoA转移酶、6-氧代己酰-CoA水解酶或6-氧代己酰-CoA连接酶，4F3为6-羟基己酰-CoA转移
酶、6-羟基己酰-CoA水解酶或6-羟基己酰-CoA连接酶，2E为2-羟基-己二酸CoA-转移酶或2-
羟基己二酸-CoA连接酶、或2,6-二羟基-己酸CoA-转移酶或2,6-二羟基-己酸-CoA连接酶，
3G2为2-羟基-4氧代己二酸CoA-转移酶或2-羟基-4氧代己二酸-CoA连接酶、或2,6-二羟基-
4氧代己酸CoA–转移酶或2,6-二羟基-4氧代己酸-CoA连接酶，3G5为4-羟基己二酸CoA-转移
酶或4-羟基己二酸-CoA连接酶、或4,6-二羟基己酸CoA-转移酶或4,6-二羟基己酸-CoA连接
酶，2I为2,4-二羟基己二酰-CoA4-脱水酶(4,5-脱氢型)，3M为2,4-二羟基己二酰-CoA4-脱
水酶(2,3-脱氢型)、或2,4,6-三羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)，3H为4-羟基己二
酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)或4,6-二羟基己酰-CoA4-脱水酶(2,3-脱氢型)，2F为2-羟
基-己二酰-CoA2-脱水酶或2,6-二羟基-己酰-CoA2-脱水酶，3D3为2,4-二羟基己二酰-
CoA2-脱水酶或2,4,6-三羟基己酰-CoA2-脱水酶，3D2为2-羟基-4氧代己二酸2-脱水酶或
2,6-二羟基-4氧代己酸2-脱水酶，3D1为2-羟基-4氧代己二酰-CoA2-脱水酶或2,6-二羟

【专利技术属性】
技术研发人员：哈夏尔·乔卡瓦拉，
申请(专利权)人：兹莫克姆有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US