抗体组合物和用于其的缓冲体系制造技术

一种将分离的抗体缀合至标记物或衍生化试剂的方法，所述方法包括：在包含除甘氨酸以外的一元羧酸缓冲化合物(其带有处于在α或β位的氨基取代基)的缓冲体系中，使该抗体与经活化的标记物或经活化的衍生化试剂接触，或者在抗体缀合试剂的存在下使所述抗体与所述标记物或衍生化试剂接触。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于缀合反应中的抗体组合物、抗体分离试剂盒、用于将分离的抗体 与标记物缀合的方法以及用于此类组合物、试剂盒或方法的缓冲体系。
技术介绍
所有抗体最初均被制成粗制品形式(例如，免疫血清、腹水、杂交瘤组织培养物上 清液）。在用于许多基础研究和诊断应用中之前，必须将抗体纯化以除去许多(或全部)污染 性非抗体蛋白和小分子(例如，氨基酸）。 如果要将抗体共价连接至"标记物（label)"（例如，酶、有机染料、荧光蛋白或有色 颗粒）以产生杂交试剂(通常称作"标记抗体"或"抗体缀合物"）或者连接至衍生化试剂以引 入新的官能团，则纯化特别重要。缀合物的抗体部分赋予针对特定抗原(例如，蛋白、药物、 肽或生物标志物)的特异性，而标记物则赋予可测量性，以使该缀合物能用于对例如蛋白印 迹物、组织切片、培养的细胞、血样和尿液等中的抗原进行检测和定量。 抗体纯化中的关键步骤是抗体与抗原亲和柱或者与带有固定化的蛋白A、蛋白G或 蛋白L的柱的结合，所述柱与不直接参与抗原结合的抗体区相互作用。抗原亲和柱上的抗体 纯化是有利的，因为粗制样品中的具有不相关抗原特异性的抗体不会保留在柱上。这种亲 和纯化方法稳健可靠，且广泛用于从诸如血清、腹水和杂交瘤组织培养物上清液等粗制样 品中纯化抗体。 无论使用何种纯化方式，柱结合的抗体通常用低pH缓冲液(通常包含甘氨酸或柠 檬酸)洗脱，然后用例如Tris缓冲液(pH 8.0至9.0)快速中和，以使低pH对抗体造成的损害 最小化（例如，Thermo Scientific Protein Purification Technical Handbook,ref 1601617 07/08)。用低pH甘氨酸或柠檬酸缓冲液进行洗脱被广为采用，因为其成本低且其 在破坏抗体-抗原相互作用所需的pH值处具有良好的缓冲能力。 在储存之前，通常（但并非总是)在roS或某些其它近中性的pH缓冲液中透析中和 的纯化抗体。出于稳定化或避免微生物生长的目的，往往会将其它物质（例如，BSA、叠氮化 钠、洗涤剂)添加至经透析的抗体。 在从商业来源购买抗体时，极少情况会得到关于纯化过程中所用的透析步骤的信 息。因此，可能不清楚来自纯化过程的缓冲剂成分是否留在了最终的抗体制备物中。如果要 将抗体标记，则这样的考虑至关重要，因为用于洗脱亲和柱的缓冲剂常常会在标记反应中 造成严重干扰。 所有类型的标记物都最通常地与抗体分子上的赖氨酸残基连接。例如，有机荧光 染料的NHS酯和流行的荧光素异硫氰酸酯衍生物(FITC)与赖氨酸残基反应。虽然其他缀合 化学(例如，巯基-马来酰亚胺)可能并未明显涉及赖氨酸残基，但其几乎总是依赖于在缀合 过程早期步骤中的赖氨酸修饰。例如，赖氨酸导向型异双官能NHS酯衍生化试剂常用于将马 来酰亚胺和各种其它官能团（例如，受保护的巯基、叠氮基、碘代乙酰基）引入蛋白分子。碳 二亚胺用于将抗体缀合至羧基化微米颗粒或纳米颗粒，其涉及表面羧基与抗体中的赖氨酸 残基的反应，从而形成酰胺键。 为人熟知的是，涉及赖氨酸残基的衍生化或缀合反应不能在含伯氨基的物质（例 如，游离氨基酸）的存在下进行。这是因为这类物质会与蛋白中的赖氨酸残基竞争。在碳二 亚胺介导的反应(其涉及羧基与氨基的偶合)的情形中，现有技术的教导因竞争问题而强烈 反对使用具有羧基或伯氨基官能团的添加剂。 因此，流行的抗体洗脱缓冲剂在几乎所有类型的抗体标记方法中都是禁忌的。甘 氨酸或柠檬酸都不能出现在抗体与标记物的受碳二亚胺介导的反应中，因为该反应涉及氨 基与羧基的缩合。 例如，在 Biocon jugate Techniques，Hermanson GT，1995，ISBN 0-12-342336-8， 第102页（和更新的第2版中第117页，2008ISBN 9780123705013)中给出了以下建议："避免 含羧基或含氨基的缓冲剂，例如柠檬酸盐、乙酸盐、甘氨酸或Tris"。 Bangs Labs技术笔记205提及碳二亚胺偶联时陈述到："应该避免含有游离氨基的 缓冲剂，例如Tris或甘氨酸"。 在《Immobilization of Enzymes and Cells》，2006，Guisan JM编，第223页， ISBN1-58829-290-8)中讨论了使用含羧基微球的反应，且给出了以下警告注释："应该避免 含有游离氨基的缓冲剂，例如Tris或甘氨酸"。 来自ThermoFisher的碳二亚胺依赖性生物素化试剂盒（EZ-Lin丨<j?Amine-PEGn-Biotin，产品编码26136)注明："避免含有伯氨基的缓冲剂(Tris、甘氨酸等)或含有羧基的 缓冲剂(乙酸盐、柠檬酸盐等），因为它们会终止反应"。 G Biosciences的羧基偶联树脂的程序给出警告："注意：对于使用EDC的偶联反 应，避免使用含有游离氨基的缓冲剂或磷酸盐，因为它们会干扰偶联效率。Tris、乙酸盐和 甘氨酸缓冲剂均易与H)C或偶联中间体反应"。 最后，用于羧基化金缀合试剂盒的规程注明："蛋白溶液中的任何其它含氨基或羧 基的分子(包括蛋白稳定剂)会与缀合反应竞争"（OceanNanotech,产品编码GCK)。 在并未同时涉及羧基修饰的针对赖氨酸的修饰反应的情形中，可以容许柠檬酸， 但甘氨酸总是禁用的，例如DyLight?Amine-Reactive Dyes规程（Thermo Scientif ic，No 2032.11)称："含有伯氨基的缓冲剂(例如，Tris或甘氨酸)将会产生干扰，因为其与NHS-酯 部分发生反应"。 抗体样品中的潜在干扰性小分子(例如甘氨酸和柠檬酸)可以通过透析或脱盐而 除去，而后将抗体用于缀合反应中。透析去除这类分子的效率与抗体样品相对于透析缓冲 液的体积、透析缓冲液的更换次数以及在下一次缓冲液更换之前是否达到动态平衡有关。 这些信息对于商购抗体而言几乎总是未知的。 不幸的是，在不显著损失材料的情况下很难将商购抗体透析/脱盐，因为所述抗体 通常以少量购入(例如，1〇〇μ1，浓度约Img抗体/ml)。而且，在透析期间可能发生样品的稀 释，这可能需要后续的抗体浓缩步骤(导致进一步的材料损失)来实现用于抗体标记反应所 需的最小浓度(通常为lmg/ml)。毫克量的抗体的透析相对容易，但过程必然较慢，且如果需 要更换缓冲液数次则可能需要1至2天。高毫克级别所需的透析膜和大体积的透析缓冲液也 会增加生产成本。 本专利技术的目的在于提供克服现有技术的不足的纯化和/或缀合抗体的方法、用于 此类方法的试剂盒和抗体组合物。
技术实现思路
抗体标记技术在此前数年间得到了显著进展，特别是在工艺简化方面。多步缀合 方法正被简单的一步工艺所取代，后者对操作者而言无需特定的化学知识。 为避免缓慢、增加成本且导致抗体损失的干涉性透析步骤，需要更好地整合抗体 纯化程序和标记反应。对于"缀合友好型洗脱缓冲剂"（CFEB)存在明显的需求，因为最初被 抗体纯化科学家采用的缓冲剂与大多数缀合化学都不相容。本专利技术人在这里将CFEB限定为 pKa为1至4的缓冲剂，其不会对流行的缀合方法（即，最低限度地为抗体与碳二亚胺、NHS酯、 异硫氰酸酯、马来酰亚胺和硫醇化试剂的反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将分离的抗体缀合至标记物或衍生化试剂的方法，所述方法包括：在包含除甘氨酸以外的一元羧酸缓冲化合物的缓冲体系中，使所述抗体与经活化的标记物或经活化的衍生化试剂接触，或者在抗体缀合试剂的存在下使所述抗体与所述标记物或衍生化试剂接触；所述一元羧酸缓冲化合物带有处于在α或β位的氨基取代基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·S·吉，B·富塞蒂，
申请(专利权)人：创新生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB