一种猪笼草离体快繁方法技术

本发明专利技术公开一种猪笼草离体快繁方法。该方法以顶芽或带侧芽的茎段为外植体，剪取外植体前4-5天用百菌清喷洒全株植株，对预选取为外植体部分用透明袋套袋。在诱导培养及继代培养培养中用两种培养基进行交替培养，对MS进行了改良。经生根培养及组培苗移栽及管理后即较快获得猪笼草营养钵苗。本发明专利技术通过外植体采前处理大大降低了外植体的污染率。改良MS培养液，增殖效果突出，为快速培育出猪笼草组培苗奠定了很好的基础。提前切除顶芽，解决了培养过程中外植体只长高不生芽的问题，实现了较短培养时间内获得大量芽体。较短时间内两种培养基交替使用，使诱导幼芽快，增加了有效苗；诱导培养及继代培养中活性炭的应用，有效防止了材料的褐化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及猪笼草离体培养及快繁的方法，属于植物组织培养

技术介绍
猪笼草又称猪仔笼、雷公壶等，是猪笼草科猪笼草属多年生草本或半木质化藤本植物，原产于亚洲东南部和大洋洲北部，全世界约有67种，虽然在我国海南和广东的湛江、珠海、中山等部分地区分布，但很少应用。直到20世纪90年代以后，引进中国的猪笼草的优良品种才主要用于花卉展览。猪笼草现已成为引人注目的观赏植物，其中由叶片变化而来的笼状变态叶造型独特，同时具有食虫特性，奇趣无比，是环保灭虫的绝佳选择，也是目前食虫植物中最受人们青睐的种类之一。其大小和颜色各不相同，有的像小酒杯、有的像罐子，颜色五彩缤纷，具有极高的观赏价值，常用作盆栽或吊盆观赏，优雅别致，观赏价值高。但由于猪笼草雌雄异株，结实率低，且种子萌发慢，发芽率低，扦插繁殖生根慢，不易成活，难以满足生产的要求。因此，以猪笼草的顶芽或腋芽为试验材料，控制好灭菌时间和使用改良培养液，以离体组织培养的方法提高其培养速度并获得大量栽培苗，可为满足种苗市场需要提供一条有效途径。
技术实现思路
为解决现有猪笼草采用种子繁殖，萌发速度慢，发芽率低;采用扦插繁殖，生根速度慢，不易成活等问题，本专利技术提供。本专利技术的技术方案如下:—种猪笼草离体快繁方法，其特征在于包括如下步骤:(I)外植体的选择与处理选择生长健壮的猪笼草植株，以顶芽或带侧芽的茎段为外植体，剪取外植体前4-5天用75%百菌清可湿性粉剂800倍液喷洒全株植株，并对预选取为外植体的植株部分用透明袋套袋;剪取长度为3?5cm的外植体用流水冲洗，去除表面污垢后，用体积分数为75%的酒精表面消毒30s;然后先放入质量浓度为0.1 %的氯化汞溶液中消毒15min，再放入混合液中消毒20min，再用无菌水冲洗3?4次;所述混合液为每10ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加2滴吐温-20;(2)诱导培养 将步骤(I)经处理的外植体接种到MS改良培养液+6-BA 1.5?2.0mg/L+NAA0.1?0.2mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L，pH为5.8?6.0的培养基中，在光照强度为1500?2000Ix，温度25°C 土 2°C，光照时间为10?12h/d的培养条件下，培养7d后转接到1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.lmg/L+活性炭0.05g/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L，pH为5.8?6.0的培养基中，在前述相同的培养条件下培养至外植体萌发分化出2.5?3.0cm高的幼芽;所述MS改良培养液为:常规MS培养液中大量元素的浓度减半，盐酸硫胺素浓度为2mg/L，盐酸吡哆醇浓度为lmg/L的培养液；(3)继代培养将步骤(2)所述分化出2.5?3.0cm高的幼芽切成单株，并切除顶芽后，转接到I/2MS+6-BA 2.5?3.0mg/L+NAA 0.I ?0.2mg/L+活性炭0.05g/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L，pH为5.8?6.0的培养基中，在与步骤(2)相同的培养条件下，培养30?35(1转接到1/2MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.lmg/L+椰子汁 100ml/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L，pH为5.8?6.0的培养基中，在与步骤(2)相同的培养条件下培养30-35天；(4)生根培养将步骤(3)中长度为2cm以上的芽，接种到盛有1/2MS+IBA 1.0mg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L，pH为5.8?6.0生根培养基的培养瓶中，再将培养瓶移至覆盖有遮光率为70%遮阳网，棚内温度为18?28°C的大棚苗床上培养至长出3?5条根；(5)组培苗移栽及管理将步骤(4)生根的组培苗取出，清水洗净，放入质量浓度为0.1 %的多菌灵溶液中消毒I?2min后，移栽至盛有珍珠岩，草炭和树皮的育苗袋中，珍珠岩:草炭:树皮的体积比为1:1:1，再将育苗袋置于棚内温度为18?28°C，空气相对湿度保持在60%以上的大棚内培养40?45d后，即得猪笼草营养钵苗。本专利技术具有下列优点和效果:1、通过外植体采前处理大大降低了外植体的污染率，降低了对材料的损失。2、MS改良培养液的使用，对于猪笼草的增殖效果更加突出，为快速培育出猪笼草组培苗奠定了很好的基础。3、提前切除顶芽的方法，成功解决了培养过程中外植体只长高不生芽的问题，实现了较短培养时间内获得大量芽体。4、采取较短时间内两种培养基交替使用措施，达到了诱导幼芽快，增加有效苗的目的；诱导培养及继代培养中活性炭的适宜应用[见步骤(2)和步骤(3)]，有效防止了材料易褐化带来的困扰。具体实施方法为了更好地说明本专利技术，给出本专利技术的实施例，各实施例无特殊说明的为常规方法。实施例1(I)外植体的选择与处理选择生长健壮的猪笼草植株，以顶芽或带侧芽的茎段为外植体，剪取外植体前4-5天用75%百菌清可湿性粉剂800倍液喷洒全株植株，并对预选取为外植体的植株部分用无色透明袋套袋;剪取长度为3?5cm的外植体用流水冲洗，去除表面污垢后，用体积分数为75 %的酒精表面消毒30s;然后先放入质量浓度为0.1 %的氯化汞溶液中消毒15min，再放入混合液中消毒20min，再用无菌水冲洗3?4次;所述混合液为每10ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加有2滴吐温-20 ；(2)诱导培养将步骤(I)经处理的外植体接种到MS改良培养液+6-BA 1.5mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖300001^/1+琼脂625011^/1，？!1为5.8?6.0的培养基中，在培养条件为光照强度为1500?20001x，温度25°C±2°C，光照时间为10h/d的培养条件下，培养7d后转接到1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.lmg/L+活性炭0.05g/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L，pH为5.8?6.0的培养基中，在本实施例1步骤(2)所述的相同培养条件下培养至外植体萌发分化出2.5?3.0cm高的幼芽;所述MS改良培养液为:常规MS培养液中大量元素的浓度减半，盐酸硫胺素浓度为2mg/L，盐酸吡哆醇浓度为lmg/L的培养液；诱导培养40d外植体即萌发分化出2.5?3.0cm高的幼芽。(3)继代培养将步骤(2)所述分化出2.5?3.0cm高的幼芽切成单株，并切除顶芽后，转接到I/2MS+6-BA2.5mg/L+NAA 0.lmg/L+活性炭0.05g/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L，pH为5.8?6.0的培养基中，在本实施例1步骤(2)相同的培养条件下，培养35d转接到1/2MS+6-BA1.5mg/L+NAA 0.lmg/L+椰子汁 100ml/L+蔗糖30000mg/L+琼脂当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪笼草离体快繁方法，其特征在于包括如下步骤：(1)外植体的选择与处理选择生长健壮的猪笼草植株，以顶芽或带侧芽的茎段为外植体，剪取外植体前4‑5天用75％百菌清可湿性粉剂800倍液喷洒全株植株，并对预选取为外植体的植株部分用透明袋套袋；剪取长度为3～5cm的外植体用流水冲洗，去除表面污垢后，用体积分数为75％的酒精表面消毒30s；然后先放入质量浓度为0.1％的氯化汞溶液中消毒15min，再放入混合液中消毒20min，再用无菌水冲洗3～4次；所述混合液为每100ml质量浓度为2％的次氯酸钠溶液中滴加2滴吐温‑20；(2)诱导培养将步骤(1)经处理的外植体接种到MS改良培养液+6‑BA 1.5～2.0mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L,pH为5.8～6.0的培养基中,在光照强度为1500～2000lx,温度25℃±2℃，光照时间为10～12h/d的培养条件下，培养7d后转接到1/2MS+6‑BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+活性炭0.05g/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L,pH为5.8～6.0的培养基中，在前述相同的培养条件下培养至外植体萌发分化出2.5～3.0cm高的幼芽；所述MS改良培养液为：常规MS培养液中大量元素的浓度减半，盐酸硫胺素浓度为2mg/L,盐酸吡哆醇浓度为1mg/L的培养液；(3)继代培养将步骤(2)所述分化出2.5～3.0cm高的幼芽切成单株，并切除顶芽后，转接到1/2MS+6‑BA 2.5～3.0mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+活性炭0.05g/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L,pH为5.8～6.0的培养基中，在与步骤(2)相同的培养条件下，培养30～35d转接到1/2MS+6‑BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+椰子汁100ml/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L,pH为5.8～6.0的培养基中，在与步骤(2)相同的培养条件下培养30‑35天；(4)生根培养将步骤(3)中长度为2cm以上的芽，接种到盛有1/2MS+IBA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L,pH为5.8～6.0生根培养基的培养瓶中，再将培养瓶移至覆盖有遮光率为70％遮阳网，棚内温度为18～28℃的大棚苗床上培养至长出3～5条根；(5)组培苗移栽及管理将步骤(4)生根的组培苗取出，清水洗净，放入质量浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至盛有珍珠岩，草炭和树皮的育苗袋中，珍珠岩：草炭：树皮的体积比为1：1：1，再将育苗袋置于棚内温度为18～28℃，空气相对湿度保持在60％以上的大棚内培养40～45d后，即得猪笼草营养钵苗。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春梅，单芹丽，汪国鲜，屈云慧，蒋海玉，阮继伟，吴丽芳，曹桦，缑辉，
申请(专利权)人：云南省农业科学院花卉研究所，玉溪云星生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53