表达方法技术

提供了生产靶多肽的方法。该方法包括表达在宿主细胞中，优选地在哺乳动物细胞中用于表达靶多肽的表达载体，以及回收该靶多肽，所述表达载体包括表达盒，该表达盒含有编码与纤连蛋白分泌前导序列可操作地连接的重组多肽的多核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及表达重组多肽，特别是分泌重组多肽的方法。如果目的多肽可以从它在其中表达的细胞中输出，这在重组多肽的生产中是明显有益的。因此，将表达系统有利地设计成使得这样的输出或分泌可行。从宿主细胞中分泌重组多肽通常涉及信号肽的使用，所述信号肽存在于注定用于从细胞质中输出的大多数真核生物和原核生物蛋白质中。用于这样的表达系统中的分泌前导区通常对于表达宿主而言是天然的，例如，大肠杆菌的PhoA、MalB和OmpA信号肽已经广泛用于将多肽分泌到该生物体的胞外周质中。US7,071,172描述了用于基因治疗的基于AAV的递送载体中的纤连蛋白分泌前导区的用途。根据本专利技术的第一方面，提供了生产靶多肽的方法，所述方法包括：a)表达在宿主细胞中表达靶多肽的表达载体，该表达载体包括表达盒，所述表达盒包括编码与纤连蛋白分泌前导序列或其功能等同物可操作地连接的重组多肽的多核苷酸；和b)回收靶多肽。可以用于本专利技术的纤连蛋白前导区包括哺乳动物和爬行动物纤连蛋白分泌前导区。爬行动物纤连蛋白分泌前导区的实例包括非洲爪蟾(Xenopuslaevis)纤连蛋白分泌前导区。哺乳动物纤连蛋白分泌前导区的实例包括人，大鼠，鼠，牛，猪，犬，猫和中国仓鼠纤连蛋白分泌前导区，和其功能等同物，例如具有序列MLRGPGPGLLLLAVQCLGTAVPSTGA(SEQIDNo.1)的人纤连蛋白分泌前导区。在某些实施方案中，优选具有氨基酸序列MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA(SEQIDNo.2)的中国仓鼠纤连蛋白分泌前导区和其功能等同物。分泌前导区的功能等同物是与氨基酸序列共享70％或更大同一性，优选75％或更大同一性，更优选80％或更大同一性，和最优选90％或更大同一性，如95％或更多，并且保留了分泌重组多肽的能力的氨基酸序列。在一些实施方案中，功能等同的分泌前导区通过任何加入，缺失或替代而相差单个氨基酸。在许多实施方案中，可操作地连接的多核苷酸序列是相邻接的，并且在分泌前导区的情况下，是邻接的并且在同一个读码框内。优选地，编码纤连蛋白分泌前导区的多核苷酸和编码靶多肽的多核苷酸之间的连接为分泌前导区连接于重组多肽的N末端。在某些实施方案中，重组多肽包含N末端标签，分泌前导序列和编码重组多肽的多核苷酸之间的连接，其中分泌前导区附着于标签，优选附着于标签的N末端。编码纤连蛋白分泌前导序列的多核苷酸优选地连接于编码靶多肽的多核苷酸的5’末端，并且优选具有序列ATGCTGAGAGGCCCTGGACCTGGACTGCTGCTGCTGGCTGTGCAGTGTCTGGGAACCGCCGTGCCTTCTACCGGCGCC(SEQIDNo.3)或ATGCTCAGGGGTCCGGGACCCGGGCTGCTGCTGGCCGTCCTGTGCCTGGGGACAGCGGTGCGCTGTACCGAAGCC(SEQIDNo.4)。本专利技术的载体包括与分泌前导区和重组多肽的表达盒可操作地连接的启动子。根据表达盒要在其中表达的宿主细胞来选择可以用于本专利技术的载体的启动子。可以用于原核生物宿主细胞中的启动子包括噬菌体聚合酶启动子，如单个T7启动子区，包括由Studier和Moffat，在J.Mol.Biol.189：113-130(1986)中公开的那些，其通过引用并入本文之中，尤其是T7基因10启动子区和宿主聚合酶启动子，特别是大肠杆菌聚合酶启动子，如T7A1、T7A2、T7A3、λpL、λpR、lac、lacUV5、trp、tac、trc、phoA和rrnB。当利用T7RNA-聚合酶依赖性启动子区时，会认识到的是需要T7RNA聚合酶源，其通过本领域已知的方法来提供，并且通常通过向宿主菌株插入表达所需的噬菌体聚合酶的λDE3原噬菌体，以产生产噬的宿主菌株而提供。T7RNA聚合酶也可以通过用携带T7RNA聚合酶的基因的特化的λ转导噬菌体感染而递送到细胞。可以用于酵母宿主细胞的启动子包括gal启动子和AOX启动子，如AOX1和AOX2、GAP(甘油醛3-磷酸脱氢酶)、FLP(甲醛脱氢酶)和GAL1和GAL10。可以用于哺乳动物宿主细胞的启动子对于宿主细胞而言是内源性的或外源性的。合适的启动子包括病毒启动子如CMV，SV40启动子和RSR-LTR。也可以使用来自管家基因的启动子如hEF1α和鼠磷酸甘油酸激酶(mPGK)的启动子。在一些实施方案中，优选的启动子是人CMV和大鼠CMV。如果一个以上的多肽要表达(例如MAbHC和LC多肽)，启动子可以相同或不同。启动子可以与增强子序列组合使用，所述增强子例如巨细胞病毒，特别是人巨细胞病毒的主要即时早期增强子。可以将表达载体整合进宿主细胞基因组或包含于染色体外元件如质粒。表达载体通常也含有对于该载体要在其中表达的宿主细胞合适的选择性标志物。用于原核宿主细胞的选择性标志物包括抗生素抗性标志物，如四环素或卡那霉素抗性标志物。用于酵母宿主中的选择性标志物包括抗生素抗性标志物，如Zeocin、嘌呤霉素、新霉素和潮霉素抗性。用于哺乳动物细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞的选择性标志物包括谷氨酰胺合成酶和二氢叶酸还原酶标志物系统。所使用的载体包括本领域常规的适于在合适的宿主细胞中表达的特征。原核表达载体通常包括复制原点，限制性酶位点，转录终止子和质粒稳定性基因座，如cer稳定性序列。酵母表达载体通常包括启动子，转录终止子，选择标志物，和如果复制，包括复制原点。哺乳动物表达载体通常包括聚腺苷酸化序列，如人β珠蛋白聚A序列，牛生长激素聚A序列，和SV40早期或晚期聚A序列。本专利技术的表达载体可以用于在宿主细胞内表达重组多肽，特别是蛋白质。可以利用原核生物，特别是真核生物的宿主细胞。原核生物细胞的实例包括细菌细胞，例如革兰氏阴性细菌细胞，包括大肠杆菌(E.coli)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，粘质沙雷菌(Serratiamarsescens)，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，和革兰氏阳性细菌细胞，包括枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。优选的原核宿主细胞是细菌，特别是肠细菌，优选地大肠杆菌，特别是它的B或K12菌株。可以利用的真核宿主细胞的实例包括酵母，哺乳动物和昆虫细胞。酵母宿主细胞特别包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产靶多肽的方法，其包括：(a)表达在宿主细胞中表达靶多肽的表达载体，所述表达载体包括表达盒，该表达盒含有编码与纤连蛋白分泌前导序列或其功能等同物可操作地连接的重组多肽的多核苷酸；和(b)回收靶多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.05.03 GB 1308017.1;2013.11.18 GB 1320339.31.生产靶多肽的方法，其包括：
(a)表达在宿主细胞中表达靶多肽的表达载体，所述表达载体包括表达盒，该表
达盒含有编码与纤连蛋白分泌前导序列或其功能等同物可操作地连接的重组多
肽的多核苷酸；和
(b)回收靶多肽。
2.生产靶多肽的方法，其包括：
(a)用在宿主细胞中表达靶多肽的表达载体转染或转化宿主细胞，该表达载体含
有表达盒，该表达盒含有编码与纤连蛋白分泌前导序列或其功能等同物可操作
地连接的所述靶多肽的多核苷酸；
(b)在允许所述宿主细胞增殖，和从所述宿主细胞中表达和分泌所述靶多肽的条
件下培养所述宿主细胞；和
(c)回收所述靶多肽。
3.根据前面的权利要求所述的方法，其中对应于所述宿主细胞选择所述纤连蛋
白分泌前导区。
4.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述表达盒包括hEF1α启动子。
7.根据权利要求4到7的任一所述的方法，其中所述表达盒包括聚A序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述聚A序列选自人β珠蛋白聚A，牛生
长激素聚ASV40早期或晚期聚A序列。
9.根据前述任一权利要求的方法，其中所述纤连蛋白分泌前导区具有序列
MLRGPGPGLLLLAVQCLGTAVPSTGA或
MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA。
10.根据前述任一权利要求所述的方法，其中利用了两个表达盒，一个表达盒含
有编码单克隆抗体的轻链的多核苷酸，第二个表达盒含有编码单克隆抗体重链
的多核苷酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述两个表达盒包括相同的启动子，分
泌前导区和聚A序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述宿主细胞是CH...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·L·桑德斯，A·L·多兹，A·M·G·贝亚德，B·V·卡拉，
申请(专利权)人：富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB