一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法技术方案

本发明专利技术一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法。在对含有内源CRISPR-Cas系统的原核生物进行基因组编辑时，只需构建一个同时携带人工CRISPR簇和供体DNA的编辑质粒，在内源CRISPR系统对基因组发生DNA干涉后通过同源重组达到对基因组的编辑。其最大的优点在于：应用宿主范围广，所有含有内源CRISPR-Cas系统的细菌和古菌均可操作；可用于多种编辑方式，缺失、插入和点突变等均可操作；更高的编辑效率，筛选阳性率高，背景低；流程简单，时间周期短，大大减轻原核生物基因组编辑的工作量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因组学及基因工程和生物
，具体设及到一种利用内源 CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法。
技术介绍
CRISPR-Cas系统作为一种原核生物抵御病毒等外源入侵核酸的获得性免疫系统， 广泛存在于大约90%的古菌和40%细菌中（VanderOostJetal.,2014;BarrangouR etal.，2014)。CRISPR-Cas系统被划分为Ξ个主要类型：I型，II型和III型；它们分别有 一个标志性蛋白：Cas3,Cas9 和Casio(MakarovaKSetal.，2011)。II型CRISPR系统仅 需要化s9 -个蛋白与一条crRNA和trans-actingRNA行使DNA干设活性值eltchevaE etal.，2011;GasiunasGetal.，2012)。简单的II型CRISPR系统因此被开发成真核生 物基因组编辑工具（JinekΜetal.,2012;WangΗet曰1.,2013)，并广泛应用于不同的真 核生物和细菌值OU化aJAetal. , 2014;SanderJDetal. , 2014;HsuPDetal. , 2014 ; SelleKetal. , 2015)〇 在过去的十年中，各个实验室在一些古菌模式种里建立起了有效的遗传操作体系 和工具化ei曲JAetal.，2011)。尽管如此，古菌的遗传学研究因其独特的生长条件，生长 缓慢W及对大多数抗生素不敏感等因素而仍然显得非常具有挑战性的（ValentineDLet al.，2007)。因此，居于CRISra系统的基因组编辑方法在古菌中的应用仍然有待研究和开 发。 目前基于CRISPR系统的基因组编辑工作所利用的均是II型CRISPR系统即 CRISPR/tas9体系，而CRISPR/tas9系统也存在诸多局限性。首先，CRISPR/tas9可能存在 脱祀效应，已经有研究发现化s9蛋白可能会容许crRNA与祀标序列之间存在一定程度的 错配，而运些错配出现的数量和位置必然会影响到基因编辑的特异性。其次，利用外源的 CRISPR/tas9系统，需要对化s9蛋白进行适用于宿主细胞的优化改造，并需同时在细胞内 表达化s9蛋白和sgRNA(向导RNA)才能发挥作用，使用程序比较复杂。另外，在一些生长 条件极端的生物中，胞内环境可能会影响到化s9蛋白的活性，从而限制了CRISPR/tas9系 统的应用。 本专利技术针对W上问题，我们提出了利用原核生物自身的CRISPR系统做基因组编 辑。该方法同时利用了CRISPR系统的DNA干设活性和同源重组，因此极大程度上避免了脱 祀效应，增强了编辑特异性。该方法只需要构建一个同时携带人工CRISra簇和供体DNA的 编辑质粒，流程简单，操作周期短。该方法利用的是原核生物自身的CRISIS系统，所有含有 内源CRISPR-Cas系统的细菌和古菌均适用。 硫化叶菌是CRISPR研究的模式生物，关于硫横矿硫化叶菌S.solfatari州SP2和 冰岛硫化叶菌S.islandicusREY15A中I型和III型CRISPR-Cas系统的研究表明其均具 有DNA和（或）RNA干设活性（ManicaAetal.，2011;ManicaAetal.，2013;ZebecZet al. , 2014;GudbergsdottirS. , 2011)。我们发现在冰岛硫化叶菌S.islandicusREY15A中I-A型和III-BCmr-α均具有DM干设活性值engLetal.，2013K"CCN"和"TCN"是冰岛 硫化叶菌I-ACRISPR系统DM干设活性所需的两个PAMs(protospacer-adjacentmotifs) 化illestolR.Κetal.，2009)。而III-B型CRISPR所介导的DM干设活性是不需要PAM 序列的，但其依赖于转录，并需确保crRNA5'端repeat序列与protospacer上游序列错配 值engLetal. , 2013)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供含有CRISPR-Cas系统的原核生物在内源编辑原核生物基 因组中的应用，所述的原核生物为含有内源I型或III型CRISPR-Cas系统，或同时含有内 源I型和III型CRISPR-Cas系统的细菌。 本专利技术的另一个目的在于提供一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基 因组编辑的方法，通过构建一个同时携带人工CRISPR簇和供体DNA的编辑质粒，在内源 CRISPR系统对基因组发生DNA干设后通过同源重组达到对基因组的编辑。 为了达到上述目的，本专利技术采取W下技术措施： 本专利技术所要保护的内容包括，含有CRISPR-Cas系统的原核生物在内源编辑原核 生物基因组中的应用；内源CRISPR-Cas系统在编辑原核生物基因组中的应用。 ，包括W下步骤： 1)构建基因组编辑质粒： 在原核生物基因组上拟编辑区域选取一段序列作为protospacer即祀标位点，根 据protospacer设计两条反向互补的引物，其序列分别为正向引物：5' -AAAG-N"-3'，反向 引物：5' -TAGC-N'。-3'，其中N。和Ν'。为反向互补序列，N和Ν'表示碱基A、T、G或C，n表 示protospacer的碱基个数；将上述两条引物退火形成具有粘性末端的双链DNA，即spacer 片段；人工CRISPR载体pSe-化经过限制性内切酶BspMI酶切处理，然后与具有粘性末端的 spacer片段酶连，得到能产生成熟的crRNA的人工CRISPR质粒（pAC);再将包含突变序列 和与宿主细胞基因组上祀标位点两端同源的供体DNA片段插入到上述pAC质粒上，得到基 因组编辑质粒（pGE); 所述的供体DM片段由左右两条同源片段与中间设计的突变序列通过S0E-PCR的 方法扩增而成。 2)突变株的获得：pGE质粒电转入原核生物感受态细胞后，质粒上的人工CRISPR 簇转录出pre-crRNA，pre-crRNA在细胞内被加工成成熟的crRNA;crRNA与细胞内源的 CRISPR-Cas蛋白形成crRNP复合体，通过crRNA与宿主细胞基因组上的目标DNA链配对来 识别祀标位点进行切割；随后质粒上的供体DNA片段与祀标位点两侧序列发生同源重组， 进而得到基因组编辑突变株。W上所述的步骤中，所述的原核生物为含有内源I型或III型CRISPR-Cas系 统，或同时含有内源I型和III型CRISPR-Cas系统的细菌或古菌，包括但不限于冰岛硫 化叶菌（优选原核冰岛硫化叶菌S.islandicusREY15A)，为所有含有内源CRISPR-化S 系统的细菌和古菌，例如：大肠杆菌Escherichiacoli，表皮葡萄球菌Staphylococ州S epidermidis，腐贝女希瓦菌Shewanellaputrefaciens，嗜热细菌Thermusthermophilus，嗜 热链球菌Streptococcusthermophilus，强烈火球菌Pyrococ州sfuriosus，嗜酸热硫化叶 菌Sulfolobusacidocaldarius，硫横矿硫化叶菌Sulf本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有CRISPR‑Cas系统的原核生物在内源编辑原核生物基因组中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：佘群新，梁运祥，李英俊，潘赛夫，任敏，冯明霞，彭楠，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42