用于检测肉制品中鸭源性成分的特异性引物、探针、试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一组用于检测肉制品中鸭源性成分的特异性引物和探针；所述引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术还提供了一种定量检测肉制品中鸭源性成分含量的方法和检测试剂盒。本发明专利技术的检测方法及检测试剂盒具有检测准确，灵敏度高，特异性强，简便快速等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食品检验和生物学检测
，具体涉及一种用于定量检测肉制品 中鸭源性成分的特异性引物、探针、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
近年来，我国肉制品市场中肉类掺假问题日益严重，在经济利益的驱使下，一些不 法分子为牟取暴利而掺杂使假，将相对廉价的鸭肉、猪肉等深加工后冒充牛羊肉进行销售； 其中，相对于猪肉，鸭肉的纹理色泽和牛羊肉最为接近，因此，市售牛羊肉及其制品中，很多 都掺杂鸭肉冒充牛羊肉进行销售，为弥补羊肉味不足，有的甚至掺入羊肉粉，羊肉精膏等添 加剂来粉饰其掺假行为。肉制品掺假的行为，严重侵害了消费者的权益，因此，对食品监管 部门而言，建立一种快速、简便、有效的检测肉制品中鸭源性成分的方法非常必要。 随着现代生物学的发展，食品中肉类成分的鉴别与分析已逐步形成了分别以蛋白 质和核酸检测为基础的方法体系，其中以PCR技术为基础的种属检测技术最为突出。但是 普通PCR的扩增效率低，qPCR需建立标准曲线及容易出现假阳性等因素，使得其定量体系 需进一步完善。微滴式数字PCR方法（Droplet digital PCR，ddPCR)是近年来发展起来的 快速、准确、可实现DNA绝对定量的PCR方法。其原理是通过微滴发生器把PCR反应体系生 成约20000个微滴，PCR扩增后通过微滴分析仪读取阳性微滴数目，再根据泊松分布计算出 样本中的DNA拷贝数。ddPCR与qPCR方法相比，灵敏度高，无需核酸标准品，就可对起始样 品进行绝对定量，可以用于物种鉴定、致病菌、转基因及肉源性成分检测等。因此，研究和建 立肉制品中鸭源性成分的ddPCR检测方法对肉制品中鸭源性的快速、准确的定性和定量检 测具有重大意义。 β-actin基因是构成细胞骨架的主要成分一一肌动蛋白的一种单拷贝基因，具有 基因序列高度保守、能在不同组织细胞中稳定表达、mRNA表达数量高且稳定的特点。本申 请根据鸭的β-actin基因，设计一种特异性的引物、探针，建立一种定量检测肉制品中鸭 源性成分含量的方法，并组装成试剂盒，为相关部门定量分析检测肉制品中鸭源性成分提 供有力的科学依据。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种用于检测肉制品中鸭源性 成分的特异性引物和探针；本专利技术的另一目的是提供一种定量检测肉制品中鸭源性成分含 量的方法；本专利技术的再一目的是提供一种检测肉制品中鸭源性成分的试剂盒。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为： 本专利技术提供了一种检测肉制品中鸭源性成分的特异性引物，所述特异性引物的核 苷酸序列为： 上游引物：5' -TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3'（SEQ ID NO. 1)， 下游引物：5' -GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3'（SEQ ID NO. 2)。 本专利技术还提供了一种与上述引物配合使用的探针，所述探针的核苷酸序列为： 5'-H-TCCTGGTGTTAGGTTGTAAACGCTTG-Q-3'（SEQ ID 勵.3)，其中，!1为荧光报告基团，〇为荧 光淬灭基团。 优选地，所述荧光报告基团为HEX，所述荧光淬灭基团为BHQ1。 本专利技术所述的引物和探针是通过核酸比对软件DNAMAN对GenBank中公布的多种 动物的β-actin单拷贝基因进行序列比对，筛选出鸭β-actin基因特异序列（其核苷酸 序列如SEQ ID N0. 4所示），根据筛选得到的特异序列利用Primer5. 0设计特异性引物和探 针。所有的引物和探针均由上海辉睿生物科技有限公司合成。 本专利技术还提供了一种定量检测肉制品中鸭源性成分含量的方法，具体包括以下步 骤： (1)建立鸭肉样品质量和基因拷贝数之间的线性关系式： a.鸭肉样品质量与鸭肉样品DNA浓度之间线性关系式的确定：称取至少5个（优 选为5-10个）不同质量梯度的预处理后的鸭肉样品，分别对每一个鸭肉样品进行基因组 DNA的提取，并运用核酸定量分析仪测定每个鸭肉样品基因组DNA提取物中的DNA浓度， 得到与每一个质量梯度鸭肉样品相对应的鸭肉样品DNA浓度；然后根据检测到的鸭肉样品 DNA浓度和与之相对应的鸭肉样品的质量，制作关于鸭肉样品质量-鸭肉样品DNA浓度的标 准工作曲线，得到鸭肉样品质量-鸭肉样品DNA浓度的线性关系式：C = kiM+bi，其中，Μ代 表鸭肉样品肉质量；C代表鸭肉样品DNA浓度； b.鸭肉样品DNA浓度与基因拷贝数之间线性关系式的确定：对步骤a中得到的 已知鸭肉样品DNA浓度的鸭肉样品基因组DNA提取物进行梯度稀释，稀释成系列浓度梯度 的DNA样品，然后分别以每一个稀释浓度的DNA样品作为模板，进行微滴数字PCR扩增反 应；微滴数字PCR反应结束后，采用微滴分析仪进行分析，记录每一个微滴数字PCR反应体 系中的基因拷贝数，然后根据基因拷贝数和与之相对应的模板DNA含量，制作关于模板DNA 含量-基因拷贝数的标准工作曲线，得到模板DNA含量-基因拷贝数的线性关系式：Y = k具+b2，其中，代表微滴数字PCR反应体系中模板DNA含量；Υ代表微滴数字PCR反应后 所测得的基因拷贝数； 其中，在每一个微滴数字PCR反应体系中，模板DNA含量与鸭肉样品DNA浓度、反 应体系中模板DNA的加入体积之间的线性关系式为：1^= CV/N，其中，C代表鸭肉样品DNA 浓度；V代表微滴数字PCR反应体系中模板DNA的加入体积；N代表鸭肉样品基因组DNA提 取物的稀释倍数A代表微滴数字PCR反应体系中模板DNA的含量； 将吣=CV/N代入模板DNA含量-基因拷贝数的线性关系式Y = k具+132中，即得 到鸭肉样品DNA浓度-基因拷贝数的线性关系式，即为Y = k2CV/N+b2; c.鸭肉样品质量与基因拷贝数之间关系式的确定：根据步骤a建立的鸭肉样品质 量-鸭肉样品DNA浓度的线性关系式C = hM+h和步骤b建立的鸭肉样品DNA浓度-基因 拷贝数的线性关系式Y = k2CV/N+b2，选择以鸭肉样品DNA浓度C作为中间换算变量，计算 鸭肉样品质量与基因拷贝数之间的关系，得到鸭肉样品质量-基因拷贝数的关系式，即为Μ =(NY-N b2-k2b1V) /ki^V ； (2)待检测肉制品中鸭源性成分含量的测定： 取已知质量的预处理后的待检测肉制品，提取待检测肉制品的基因组DNA，并运用 核酸定量分析仪测定其基因组DNA提取物中的DNA浓度，然后将待检测肉制品基因组DNA 提取物稀释N倍，稀释后的待检测肉制品基因组DNA提取物中的DNA浓度小于100ng/ μ L ; 以稀释后的待检测肉制品基因组DNA作为模板进行微滴数字PCR反应，微滴数字PCR反应 结束后，采用微滴分析仪测定微滴数字PCR反应体系中的基因拷贝数；然后将基因拷贝数 代入步骤⑴得到的鸭肉样品质量-基因拷贝数的关系式M= (NY-N b^kAVVkAV中， 计算待检测肉制品中的鸭肉质量；然后根据计算出的鸭肉质量，计算鸭肉质量与待检测肉 制品质量的比值，即得到待检测肉制品中鸭源性成分的百分含量； 其中，步骤⑴和步骤⑵中所述微滴数字PCR扩增反应体系优选 为20yL反应体系，其具体配置见表1 ;其中，反应体系中所述上游引物的核苷 酸序列为：5' -TGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测肉制品中鸭源性成分的特异性引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：上游引物：5’‑TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT‑3’，下游引物：5’‑GCGGAAGATACAAAAAGACACT‑3’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苗丽，陈静，张秀平，杨娜，李轲，徐超，王永杰，白杰，李志娟，王珊，
申请(专利权)人：苗丽，
类型：发明
国别省市：河南;41