在此提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织以及种子杀有害生物活性的组合物和方法。提供了包括针对毒素多肽的编码序列的组合物。这些编码序列可以用在DNA构建体或表达盒中，以便用于在植物和细菌中转化和表达。组合物还包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织、以及种子。具体地说，提供了分离的毒素核酸分子。另外，涵盖了与这些多核苷酸相应的氨基酸序列、以及与这些氨基酸序列特异性结合的抗体。具体地说，本发明专利技术提供了分离的核酸分子，这些核酸分子包含编码SEQ ID NO：21-74中所示的氨基酸序列的核苷酸序列、或在SEQ ID NO：1-20中列出的核苷酸序列、以及它们的变体和片段。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】毒素基因及其使用方法相关申请的交叉引用本专利申请要求于2013年3月7日提交的美国临时申请序列号61/774,110和各自于2013年3月8日提交的美国临时申请序列号61/774,627、61/774,629、61/774,635、61/774,638、61/774,642、61/774,645、61/774,647、61/774,650、61/774,655、以及61/774,659的权益，将其内容通过引用以其全文结合在此。对以电子方式提交的序列表的引用所述序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式序列表以电子方式提交，文件名为“APA13-6008US01_SEQLIST.txt”，创建于2014年3月5日，并且具有411千字节大小，并且与本说明书同时提交。包含在这一ASCII格式文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其全部内容结合在此。专利
本专利技术涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖的基因。这些蛋白和编码它们的核酸序列在制备杀有害生物配制品中以及在生产转基因抗有害生物植物中是有用的。专利技术背素苏云金芽孢杆菌是形成革兰氏阳性孢子的土壤细菌，其特征在于它具有产生结晶内含物的能力，这些结晶内含物对某些目和物种的昆虫是具有特异毒性的，但是对植物以及其他非靶向的生物是无害的。因此，包括苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀昆虫蛋白的组合物可用作环境上可接受的杀昆虫剂以用于控制农业昆虫有害生物或者各种人或动物疾病的昆虫媒介。来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目的、半翅目的、双翅目的、以及鞘翅目的幼虫的有效的杀昆虫活性。这些蛋白还已经显示针对膜翅目、同翅目、虱目、食毛目、以及蜱螨亚纲有害生物目(Acaripestorder)、连同其他无脊椎动物目(如线虫动物门、扁形动物门、以及原生动物门肉鞭毛虫亚门)的活性(费特逊(Feitelson)(1993)苏云金芽孢杆菌家族树(TheBacillusThuringiensisfamilytree)，先进的工程杀有害生物剂(AdvancedEngineeredPesticides)，马塞尔穧德克尔格式(MarcelDekker,Inc.)，纽约，纽约州)。这些蛋白最初主要基于它们的杀昆虫活性而分类为CryI至CryV。主要类别是鳞翅目特异性的(I)、鳞翅目和双翅目特异性的(II)、鞘翅目特异性的(III)、双翅目特异性的(IV)以及线虫特异性的(V)和(VI)。这些蛋白进一步分类成亚家族；在每个家族内更高度相关的蛋白被指定了分组字母例如Cry1A、Cry1B、Cry1C等等。在每个分组内甚至更加密切相关的蛋白被给予诸如Cry1C1、Cry1C2等的名称。基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶标特异性描述了Cry基因的命名法(克里克莫尔(Crickmore)等人(1998)微生物学与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62：807-813)。在此分类中，每种毒素被指定了独特的名称，其中包括第一级(primaryrank)(阿拉伯数字)、第二级(secondaryrank)(大写字母)、第三级(tertiaryrank)(小写字母)、以及第四级(quaternaryrank)(另一个阿拉伯数字)。在第一级中，罗马数字已被换成阿拉伯数字。带有小于45％的序列一致性的蛋白具有不同的第一级，并且对于第二和第三级的标准对应地是78％和95％。晶体蛋白不展示杀昆虫活性，直至其被摄取并溶解在昆虫中肠之中。被摄取的原毒素在昆虫消化道中被蛋白酶水解成活性毒性分子。(霍弗特和怀特利(Whiteley)(1989)生物学评论(Microbiol.Rev.)53：242-255)。这种毒素与靶标幼虫的中肠中的顶端刷状缘受体结合并插入顶端膜中，产生离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。δ-内毒素通常具有五个保守的序列结构域和三个保守的结构性结构域(参见，例如戴马格德(deMaagd)等人(2001)遗传学趋势(TrendsGenetics)17：193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的三个β片层组成并且结构域III由“果冻卷”结构中的两个反向平行的β片层组成(戴马格德(deMaagd)等人，2001，同上)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定簇。除了δ-内毒素之外，存在若干其他已知类别的杀有害生物蛋白毒素。这些VIP1/VIP2毒素(参见例如美国专利5,770,696)是二元杀有害生物毒素，它们通过如下机制对昆虫表现强活性，该机制被认为涉及受体介导的胞吞随后细胞毒化，类似于其他二元(“A/B”)毒素的作用方式。A/B毒素，例如VIP、C2、CDT、CST，或炭疽芽孢杆菌水肿和致命毒素，最初通过“B”组分(作为单体)的特异的受体介导的结合与靶标细胞相互作用。然后这些单体形成同七聚物(homoheptamer)。然后该“B”七聚物-受体复合物充当对接平台，随后该平台约束并允许酶的一种或多种“A”组分通过受体介导的胞吞而易位到细胞溶质中。一旦到细胞的细胞溶质内部，“A”组分通过例如G-肌动蛋白的ADP-核糖基化或增加环状AMP(cAMP)的细胞内水平而抑制正常细胞功能。参见巴斯(Barth)等人(2004)微生物学与分子生物学评论(MicrobiolMolBiolRev)68：373-402。大量使用基于苏云金芽孢杆菌的杀昆虫剂已经引起菱形斑蛾——小菜蛾的田间种群的抗性(费亥(Ferré)和范里(VanRie)(2002)昆虫学年评(Annu.Rev.Entomol.)47：501-533)。最常见的抗性机制是该毒素与其一种或多种特异性中肠受体的结合的减少。这还可以赋予针对共享相同受体的其他毒素的交叉抗性(费亥(Ferré)和范里(VanRie)(2002))。由于昆虫可能带来破坏、以及通过控制昆虫有害生物在产量方面的改进，对于发现新形式的杀有害生物毒素存在着不断的需要。专利技术概述在此提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织以及种子杀有害生物活性的组合物和方法。组合物包括针对杀有害生物的和杀昆虫的多肽的核酸分子编码序列、包括那些核酸分子的载体、以及包括这些载体的宿主细胞。组合物还包括这些杀有害生物多肽序列以及针对那些多肽的抗体。这些核苷酸序列可以用在DNA构建体或表达盒中，以用于在多种生物(包括微生物和植物)中进行转化和表达。这些核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，这些合成序列已经被设计为用于在生物中表达，该生物包括但不局限于：微生物或植物。组合物还包括含有本专利技术的核苷酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织、以及种子。具体地说，提供了编码杀有害生物蛋白的分离的或重组的核酸分子。另外，涵盖了与这些杀有害生物蛋白相应的氨基酸序列。具体地，本专利技术提供了分离或重组的核酸分子，该核酸分子包括编码SEQIDNO：21-74中所示的氨基酸序列的核苷酸序列、或在SEQIDNO：1-20中列出的核苷酸序列、以及它们的生物活性变体和片段。还涵盖了与本专利技术的核苷酸序列互补的核苷酸序列、或与本专利技术的序列或其互补物杂交的核苷酸序列。另外还提供本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组核酸分子，该重组核酸分子包括核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有杀有害生物活性的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：a)在SEQ ID NO：1‑20的任一项中列出的核苷酸序列；b)编码如下多肽的核苷酸序列，该多肽包括SEQ ID NO：21‑74中任一项的氨基酸序列；c)编码如下多肽的核苷酸序列，该多肽包括与SEQ ID NO：21‑74中任一项的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.07 US 61/774，110;2013.03.08 US 61/774，645;1.重组核酸分子，该重组核酸分子包括核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有杀有害生物活性的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：a)SEQIDNO：17或18的核苷酸序列；b)编码如下多肽的核苷酸序列，该多肽由SEQIDNO：67或68中任一项的氨基酸序列组成。2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是已经被设计为用于在植物中表达的合成序列。3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列被可操作地连接至能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中表达的启动子上。4.表达盒，该表达盒包括如权利要求1所述的重组核酸分子。5.如权利要求4所述的表达盒，该表达盒进一步包括编码异源多肽的核酸分子。6.包括如权利要求1所述的重组核酸的宿主细胞，所述宿主细胞不是植物细胞。7.如权利要求6所述的宿主细胞，该宿主细胞是细菌宿主细胞。8.具有杀有害生物活性的重组多肽，该多肽选自下组，该组由以下组成：由SEQIDNO：67或68中任一项的氨基酸序列的多肽组成。9.如权利要求8所述的重组多肽，该多肽进一步包括异源氨基酸序列。10.包括如权利要求8所述的重组多肽的组合物。11.如权利要求10所述的组合物，其中所述组合物选自下组，该组由以下各项...
【专利技术属性】
技术研发人员：R塞耶，K罗伯茨，K桑普森，D莱蒂嫩，C彼得斯，L马加尔黑斯，E邓恩，
申请(专利权)人：阿则耐克斯公司，拜耳作物科学有限合伙公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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