小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法，属于显微组织切片技术领域。该方法包括以下步骤：(1)脱水：将经固定处理的小鲵科动物皮肤组织依次浸入浓度梯度50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇中脱水，每个梯度脱水45～60min；(2)透明：将经脱水处理的皮肤组织浸入100％乙醇与二甲苯的混合液中2～3min，取出后再浸入二甲苯中10～30min；(3)浸蜡：将经透明处理的皮肤组织放入二甲苯与石蜡的混合液中20～30min，取出后再分两次放入石蜡中，每次45～60min；(4)将经浸蜡处理的皮肤组织包埋，依次经切片、展片、贴片、烤片、染色、封固处理，即得；其流程简单，操作方便，获得的切片完整，图片结构清晰。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种两栖动物皮肤显微组织切片的制备方法，具体涉及用于显微观察的小鲵科动物皮肤组织切片的制备方法，属于显微组织切片

技术介绍
皮肤是两栖动物机体的第一道天然屏障，在适应和进化的过程中，担任了呼吸、调节水平衡、离子运输、抵抗猎食者、抗细菌、真菌等多方面的功能，这些功能体现了皮肤形态学特征的复杂性以及皮肤结构潜在的生理特性，对维持两栖动物的生存、开拓和适应广阔的栖息地以及多样的生态环境中起着重要的作用。小鲵科动物是亚洲特有的有尾类两栖动物，也是现生有尾目10科中第三大科，全世界现已知66种，隶属2亚科、10属。中国现已知2亚科8属30种，主要分布于东北、西南山区、华中及台湾地区。小鲵科动物生活环境可分为水栖型和陆栖型，由于生活环境导致不同生活环境的小鲵科动物之间皮肤形态结构特征的差异，这些形态特征的差异为小鲵科动物的适应进化研究提供了基础数据；同时小鲵科动物被认为是有尾类中最原始的类群，故皮肤形态结构的研究可为两栖动物的进化研究提供依据。故皮肤形态结构特征在两栖动物中，特别是小鲵科动物中的研究受到众多学者的关注。要研究皮肤的形态结构特征，皮肤石蜡切片的制作是必不可少的一步。非专利文献《小鲵科动物外部形态特征和皮肤组织的形态学研究》(张向，2014)公开了一种小鲵皮肤石蜡切片制作方法，包括:(I)取材:所采集的小鲵皮肤组织块一般不宜过大，以(3?5mm) X (3?5mm)为宜，固定后流水冲洗24h ； (2)脱水:依次放入70%乙醇2h、80%乙醇2h、85% 乙醇 lh、90% 乙醇 lh、95% 乙醇 lh、100% 乙醇 I lOmin、100 % 乙醇 II 1min ； (3)透明:将脱水后的组织放入正丁醇I 15min，正丁醇II 15min进行透明处理；(4)浸蜡:将皮肤组织放入石蜡I浸蜡30min，再放入纯石蜡II浸蜡2h ; (5)包埋:使用75°C左右的石蜡包埋；(6)切片:用单面刀片先将蜡块四周修整平行并切成方形或长方形，把蜡块粘附在木块上，调整刀片与石蜡切片约成5°角，切片厚度为4?6μπι;(7)展片、贴片、干燥:将切好的组织片用毛笔卷起，慢慢平摊于44°C的温水中进行展片，然后用载玻片将切片挑起，放入烘烤箱中，烘片以玻片没有明显水渍为准；(S)HE染色:将石蜡切片组织放入二甲苯15min、100% 乙醇 10min、95% 乙醇 5min、85% 乙醇 5min、75% 乙醇 5min、蒸饱水 5min、苏木素lOmin、流水冲洗5min、I %盐酸酒精分色40s左右、流水冲洗蓝化30min、70%乙醇2min、80%乙醇2min、伊红乙醇5min、95%乙醇4min、100%乙醇4min，再放入二甲苯1min (共计lh58min)，然后用中性树胶封片；(9)封固:在载玻片1/3处滴中性树胶，用右手持细镊轻轻地夹住盖玻片的右侧，并把它的左边放在树胶的左边，然后左手持解剖针扶住盖玻片的左边，右手将镊子松开逐渐下降，慢慢抽出，使树胶在盖玻片均匀地展开并将其中气泡排出，干燥，用二甲苯擦干净盖玻片周围多余溢出的树胶，即得。然而，该方法存在以下不足之处:(I)脱水不完全，造成石蜡渗透不完全，在切片时引起组织出现破碎或空洞，摊片时切片散开，染色时托片和着色不良等；(2)正丁醇脱水效果不佳；(3)浸蜡过程由于缺乏过渡步骤，导致从透明步骤携带的二甲苯进入石蜡中，从而造成石蜡浓度降低，另外浸蜡时间过长造成组织块脆硬。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，该方法可有效去除组织块中的水分，防止石蜡渗透不全；提高透明效果，浸蜡时间相对缩短，可防止组织块脆硬。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是:，包括以下步骤:(1)脱水:将经固定处理的小鲵科动物皮肤组织依次浸入浓度梯度50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇中脱水，其中95%、100%乙醇各重复两次，每个梯度脱水45 ?60min ；(2)透明:将经脱水皮肤处理的组织浸入100%乙醇与二甲苯的混合液中2?3min，取出后再浸入二甲苯中10?30min ；(3)浸蜡:将经透明处理的皮肤组织放入二甲苯与石蜡的混合液中20?30min，取出后再分两次放入石錯中，每次45?60min ；(4)将经浸蜡处理的皮肤组织包埋，依次经切片、展片、贴片、烤片、染色、封固处理，即得。步骤(1)中乙醇浓度的增加和脱水时间的增加能够更加有效的去除组织块中的水分，从而保证石蜡充分的渗透进入组织细胞，否则将造成石蜡渗透不完全，在切片时引起组织出现破碎或空洞，摊片时切片散开，染色时托片和着色不良等。步骤(1)中所述脱水在室温下进行。步骤(2)中所述100%乙醇与二甲苯的体积比为1:1。步骤(2)中二甲苯在小鲵科动物皮肤组织切片中的透明效果最好，能较好的溶解石蜡。步骤(3)中采用二甲苯与石蜡的混合液的目的是在透明与浸蜡步骤之间增加一个过渡步骤，以防切片在透明步骤带入过多的二甲苯进入石蜡，从而导致石蜡浓度的降低；同时增加二甲苯与石蜡的过渡步骤后可适当缩短浸蜡时间，以防浸蜡时间过长造成组织块脆硬。步骤(3)中所述二甲苯与石蜡的体积比为1:1。步骤⑷中所述切片的厚度为4?6 μπι，切片后置于42?45°C的水中展片。步骤(4)中所述贴片、烤片为:待切片自然伸展平后从水中取出，控干水分，置于37?45°C下干燥2?4h，或者于室温下自然干燥一夜，亦或将切片置于载玻片上，加少量水后持载玻片在酒精灯上加温，使切片伸展。步骤(4)中所述染色为Η.E染色，操作步骤为:将切片依次置于二甲苯I lOmin、二甲苯 II lOmin、100 % 乙醇 I 5min、100 % 乙醇 II 5min、95 % 乙醇 5min、85 % 乙醇 5min、75%乙醇5min、水5min、苏木精染液10?20min，流水冲洗5min，再置于HC1-乙醇分化液20?40s，流水冲洗10?30min，镜检，流水冲洗2min，再依次置于70%乙醇lmin、85%乙醇 lmin、伊红染液 2min、95% 乙醇 I 2min、95% 乙醇 II 2min、100% 乙醇 I 2min、100% 乙醇Il2min、二甲苯I 5min、二甲苯II 5min。其中，1、II仅代表处理次数，如二甲苯I lOmin、二甲苯II 1min分别为二甲苯第一次处理lOmin，二甲苯第二次处理lOmin。所述苏木精染液为:将Ig苏木精溶于20mL 100%乙醇中得甲液，50g钾明矾溶于300mL蒸馈水中得乙液；将甲液、乙液混合，煮沸2?3min，再加蒸馈水定容至100mL ;最后加入0.2g碘酸钠，即得。所述伊红染液为:将0.5g伊红加入到10mL 85%乙醇中，溶解完全，即得。所述HCl-乙醇分化液为:将ImL盐酸加入到99mL 70%乙醇中，混匀，即得。本专利技术的有益效果:本专利技术中包括取材、固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、修整、切片与展片、贴片与烤片、H.E染色、封固等步骤，流程简单，操作方便。同时，该方法可有效去除组织块中的水分，防止石蜡渗透不全；提高透明效果，浸蜡时间相对缩短，可防止组织块脆硬，获得的切片完整，图片结构清晰，为研究小鲵科动物皮肤结构提供了技术支本文档来自技高网...

【技术保护点】
小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)脱水：将经固定处理的小鲵科动物皮肤组织依次浸入浓度梯度50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇中脱水，其中95％、100％乙醇各重复两次，每个梯度脱水45～60min；(2)透明：将经脱水处理的皮肤组织浸入100％乙醇与二甲苯的混合液中2～3min，取出后再浸入二甲苯中10～30min；(3)浸蜡：将经透明处理的皮肤组织放入二甲苯与石蜡的混合液中20～30min，取出后再分两次放入石蜡中，每次45～60min；(4)将经浸蜡处理的皮肤组织包埋，依次经切片、展片、贴片、烤片、染色、封固处理，即得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：熊建利，刘秀英，孙原野，张亚男，胡益源，吕云云，孙平，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41