一种快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的方法，包括如下步骤：(1)将受精后正常斑马鱼胚胎移入培养孔中；(2)对培养孔中的斑马鱼胚胎连续给药孵育，记为待测化合物组；(3)观察斑马鱼胚胎肝脏，记录并计算斑马鱼胚胎肝脏面积和斑马鱼胚胎体面积；(4)根据待测化合物组的斑马鱼胚胎的肝脏面积指数与正常斑马鱼胚胎的肝脏面积指数的范围的关系，判断待测化合物是否具有肝脏毒性；本发明专利技术首次将肝脏面积指数作为斑马鱼肝功能评价的检测指标，更加科学、客观，提高了结果的准确性。建立的化合物对斑马鱼肝功能损伤作用的评价模型具有制作简单、快速、稳定可靠和重复性好的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及，属于毒理学 检测

技术介绍
药物毒性问题是医药行业发展的关键问题，药物性肝损伤是最常见的药物不良反 应。随着新药的不断问世，药物性肝损伤的发病率也相应增加。很多药物的赋形剂、中草药 W及保健药亦有导致肝损伤的可能。药物引起的肝脏毒性是导致新药研发失败或上市后从 市场撤出的主要原因之一，据统计大约有1/3的药物因为肝脏毒性从市场撤出。美国FDA 批准上市的药物中，80%W上的黑框警告药物属于严重肝毒性药物，肝毒性研究位于所有 药物不良反应研究的首位。 虽然近年来对候选化合物或新药的肝脏毒性早期筛查越来越引起人们的重视，但 与之相适应的快速动物筛选模型、简单的分析检测技术和精确的评价指标仍较匿乏。目前 在临床前研究中，主要使用大鼠、小鼠体内实验和人肝细胞体外实验检测药物肝脏毒性。运 些检测方法具有一定的局限性，细胞实验不能准确反应药物在体内微环境下的活性。哺乳 动物模型虽然具有结果可靠、综合全面的优点，但是所需的候选物样品量大，且耗时、耗资、 耗力，不适合高通量筛选与毒性评价研究。 近十多年来，国外的研究发现斑马鱼可用于建立多种人类疾病模型并用于药物毒 性研究。斑马鱼的优势在于：（1)斑马鱼全基因组测序于2009年完成，与人类基因的相似 度达87%。两者在基因和蛋白质的序列和功能上表现很高的保守性，意味着在斑马鱼上做 药物毒性试验所得结果在多数情况下也适用于人体。（2)胚胎体外发育，受精后2地，主要 器官原基已形成，相当于28d的人类，实验周期短。（3)胚胎透明，可在显微镜下直接观察胚 胎发育过程，全程、完整观察药物对其体内器官的毒性作用，避免处死或解剖动物。（4)物种 稳定，繁殖周期短，饲养方便，费用低。斑马鱼拥有其他动物所无法相比的优点，其复制出的 疾病与人类疾病有高度相似性，具有可靠性、可控性、易行性和经济性等特点。采用斑马鱼 进行药物肝毒性评价不仅可减少受试药物的用量，克服早期新药研发中候选物样品量不足 导致无法采用传统的动物实验对药物的潜在毒性作用进行深入评价的问题，同时可在短期 内完成对化合物毒性评价与毒性机制的研究工作，明显缩短研究周期，降低研究成本，有助 于在细胞和分子水平阐明药物肝脏毒性作用机理。 阳0化]中国专利文献CN(申请号201010170675. 2)公开了一种用模式生物斑马鱼筛选肝 损伤药物的方法，但是该方法利用成年斑马鱼进行筛选，实验周期长、所需费用高、不适合 高通量筛选。 中国专利文献CN102353663A(申请号201110190076. 1)专利公开了一种用斑马鱼 定量评价化合物肝毒性的方法，该方法通过选定斑马鱼整个肝脏区域，计算肝脏明亮度总 和来评价化合物的肝脏毒性，但是该方法使用普通斑马鱼幼鱼，体式显微镜下观察肝脏与 其他脏器的界限不是完全清晰可辨，肝脏区域的选择误差较大，导致肝脏明亮度总和的计 算误差大，影响实验结果的准确性。 中国专利文献CN104297222A(申请号201410548844.讶公开了一种斑马鱼胚胎酒 精肝检测模型的构建方法，但是该方法未考虑到斑马鱼幼鱼本身发育的个体差异问题，导 致实验结果的误差较大。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作 用的方法，建立一种具有快速、准确、高通量特点的化合物肝脏毒性评价体系。 阳009] 本专利技术的技术方案如下： ，包括如下步骤： (1)将受精后2~4天的发育正常斑马鱼胚胎移入培养孔中； (2)对培养孔中的斑马鱼胚胎连续给药解育1~3天，记为待测化合物组； (3)观察斑马鱼胚胎肝脏，记录并计算斑马鱼胚胎肝脏面积和斑马鱼胚胎体面积， 按照如下公式计算肝脏面积指数： 肝脏面积指数=肝脏面积/体面积X100 % ; (4)当步骤（3)计算的待测化合物组的斑马鱼胚胎的肝脏面积指数不在正常斑马 鱼胚胎的肝脏面积指数的范围内，且达到统计学上的显著性水平（P<〇. 05)，则待测化合物 具有肝脏毒性；当步骤（3)计算的待测化合物组的斑马鱼胚胎的肝脏面积指数在正常斑马 鱼胚胎的肝脏面积指数范围内，则待测化合物不具有肝脏毒性； 所述的正常斑马鱼胚胎的肝脏面积指数为： 受精后3d的斑马鱼肝脏面积指数为0.40~0.68 %，受精后4d的斑马鱼肝脏面积 指数为1. 99~2. 66 %，受精后5d的斑马鱼肝脏面积指数为3. 07~3. 82 %，受精后6d的斑 马鱼肝脏面积指数为3. 93~4. 84%，受精后的7d斑马鱼肝脏面积指数为3. 25~4. 39%。 根据本专利技术优选的，所述斑马鱼胚胎为肝脏特异表达巧光的斑马鱼胚胎。肝脏特 异表达巧光的斑马鱼胚胎可采用本领域普通市售产品，如国家斑马鱼资源中屯、销售的转基 因斑马鱼。 根据本专利技术优选的，所述步骤（1)中斑马鱼胚胎为受精3~6天的斑马鱼胚胎。受 精3天W上，斑马鱼胚胎肝脏已完成发育，有利于实验效果的准确性。 根据本专利技术优选的，所述步骤似中解育，溫度为26~30。光照解育，每天更换 含待测化合物的培养液。 根据本专利技术进一步优选的，所述培养液组分如下： NaCl5mM，KC1 0. 17mM，CaClz0. 4mM，M拆〇40. 16mM，去离子水配制。 根据本专利技术优选的，所述步骤（3)还包括观察前的预处理步骤、；将需要观察的斑 马鱼胚胎用质量浓度为0. 3%。的=卡因浸泡40~90s进行麻醉，然后用3%甲基纤维素固 定于载玻片上。 根据本专利技术优选的，所述步骤（3)的观察为在巧光显微镜下观察。根据本专利技术优选的，所述步骤（3)的记录为拍照记录。 根据本专利技术优选的，所述步骤（3)的计算为利用图像处理软件计算。 根据本专利技术优选的，所述步骤（2)中，待测化合物组至少做=组平行实验，每组斑 马鱼胚胎总数不低于15枚。进一步优选的，每组斑马鱼胚胎总数为30~50枚。 阳0測原理分析 本专利技术随机选取不同的健康斑马鱼雌雄亲鱼，配对产卵，收集得到不同发育阶段 的斑马鱼胚胎，每组30个，按上述方法利用图像处理软件计算斑马鱼的肝脏面积、体面积。 根据如下公式计算各组斑马鱼的肝脏面积指数： 肝脏面积指数=肝脏面积/体面积X100%。 W31] 根据如下公式计算各组斑马鱼肝脏面积和肝脏面积指数的变异系数 (OV):C-V:=sZXX100%,,变异系数是衡量各检测值变异程度的一个统计量，为无量纲量， 可W消除单位和（或）平均数不同对两个或多个检测指标变异程度比较的影响。变异系数 越小，测定结果的偏差程度越小；反之，变异系数越大，测定结果的偏差程度越大。结果发现 各组斑马鱼肝脏面积指数的变异系数均小于肝脏面积的变异系数，说明肝脏面积指数的检 测结果比肝脏面积的检测结果更稳定，离散度更小，精密度更高。结果如表1所示：表1不同发育阶段斑马鱼的肝脏面积和肝脏面积指数的变异系数（％ )连续分批检测不同发育阶段（3化f、4化f、5化f、6化f、7化f)的斑马鱼肝脏面积、 体面积，每批30个胚胎，连续检测5批，按上述方法中步骤（2) (3)，利用图像处理软件计算 斑马鱼的肝脏面积、体面积。根据如下公式计算各批次斑马鱼的肝脏面积指数：肝脏面积指 数二肝脏面积/体面积X100%。根据如下公式计算各批次间斑马鱼肝脏面积本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将受精后2～4天的发育正常斑马鱼胚胎移入培养孔中；(2)对培养孔中的斑马鱼胚胎连续给药孵育1～3天，记为待测化合物组；(3)观察斑马鱼胚胎肝脏，记录并计算斑马鱼胚胎肝脏面积和斑马鱼胚胎体面积，按照如下公式计算肝脏面积指数：肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％；(4)当步骤(3)计算的待测化合物组的斑马鱼胚胎的肝脏面积指数不在正常斑马鱼胚胎的肝脏面积指数的范围内，且达到统计学上的显著性水平(P<0.05)，则待测化合物具有肝脏毒性；当步骤(3)计算的待测化合物组的斑马鱼胚胎的肝脏面积指数在正常斑马鱼胚胎的肝脏面积指数范围内，则待测化合物不具有肝脏毒性；所述的正常斑马鱼胚胎的肝脏面积指数为：受精后3d的斑马鱼肝脏面积指数为0.40～0.68％，受精后4d的斑马鱼肝脏面积指数为1.99～2.66％，受精后5d的斑马鱼肝脏面积指数为3.07～3.82％，受精后6d的斑马鱼肝脏面积指数为3.93～4.84％，受精后的7d斑马鱼肝脏面积指数为3.25～4.39％。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张云，刘可春，韩利文，王雪，何秋霞，孙晨，王希敏，楚杰，韩建，王荣春，
申请(专利权)人：山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37