本发明专利技术涉及一种锥栗优势共生菌根菌的人工培养方法，所述方法包括以下步骤：(1)取锥栗菌根菌子实体，采集菌盖与菌柄交汇处的菌肉组织块；(2)将菌肉组织块置于平板培养基中，在25～28℃下培养至菌肉组织萌发出菌丝后，将菌丝转接，在25～28℃下培养至菌丝长满培养基，获得纯菌丝；(3)挑取所述纯化菌丝，接种到改良MMN液体培养基中发酵培养，获得菌液；(4)将菌液接种到扩大培养料中，在25～28℃下培养至菌丝长满培养容器，获得锥栗菌根菌剂。本发明专利技术锥栗菌根菌的人工培养方法，操作简单，利用发明专利技术培养得到的锥栗菌根菌回接锥栗幼苗时侵染率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于菌根菌人工培养领域，具体涉及一种锥栗菌根菌人工培养方法。
技术介绍
外生菌根（Ectomycorrhizalfungi,ECMF)是由植物营养根系与土壤真菌共生形 成的，自然界中普遍存在。外生菌根真菌可以扩大宿主植物根系的吸收营养物质的面积，产 生多种有机酸、酶、抗生素等物质，加速生态系统中有机物和氮、磷、钾、钙、镁等的无机物循 环，改善植土壤营养状况，促进宿主植物生长，同时对根部土传病害有拮抗作用，能增强植 物的抗逆性。外生菌根真菌影响宿主植物根际的微生物组成和数量，在建设苗圃、引进树种 中应用外生菌根真菌可以提高成活率，外生菌根真菌在干旱地及撂荒地等气候条件恶劣的 地区造林作用更加明显。外生菌根真菌侵染宿主植物根系后，一方面形成哈蒂氏网和菌套， 另一方面菌丝向外延伸形成致密的菌丝网，甚至形成菌索。由于多数外生菌根真菌对寄主 不具有严格的专一性，外延菌丝伸展过程中接触到其它可与其共生的寄主植物的根系后也 可再度侵染，形成根间的菌丝桥。菌丝桥的建立使不同植株之间形成了源库关系，使植物 间可传递N、P、K和水分等物质，从而使受体植物的营养状况得到改善。 锥栗根系与外生菌根菌存在共生关系。在锥栗栗园林下，可以看到不同形状和颜 色的锥栗菌根菌的子实体，如马勃、饿膏菌、牛肝菌、红菇和鸡枞菌等。 外生菌根真菌对锥栗的正常生长具有极其重要的作用，能提高锥栗根系对土壤中 水分和养分的吸收能力。锥栗多生长在山区，在土壤贫瘩的锥栗园，土壤养分含量低，施肥 困难。因此，山区的锥栗常因着生位置、株龄不同表现出植株营养状况和生长势很大差别。 在锥栗常规嫁接育苗中，由于苗床或培养基中缺乏能与锥栗根系共生的菌根菌，所以，移栽 到大田的常规嫁接苗，成活率低，生长发育迟缓。然而，锥栗根系与外生菌根菌的共生关系 十分复杂，许多菌根真菌的分离培养比较困难，锥栗菌根化研究还未有报道。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种锥栗菌根菌人工培养方法，培养得到与锥栗根系有良好共生 关系的锥栗菌根菌。 本专利技术所述锥栗又名珍珠栗，拉丁名为Castaneahenryi(Skam)Rehd.etWils.， 壳斗科栗属，落叶乔木，是我国重要木本粮食植物之一。其果实可制成栗粉或罐头；木材坚 实，可供枕木、建筑等用；壳斗木材和树皮含大量鞣质，可提制栲胶，具有极大的经济价值。 本专利技术所述锥栗优势共生菌根菌（简称锥栗菌根菌）为与锥栗根系具有优势共生 关系的外生菌根菌。具体包括与锥栗根系共生的马勃、饿膏菌、牛肝菌、红菇、鸡枞菌等；优 选为与锥栗根系共生的橙黄硬皮马勃（SclerodermacitrinumPers.)或正红燕（Russula vinosaLindblad1901)〇 具体的，本专利技术提供了一种锥栗菌根菌人工培养方法，包括以下具体步骤： (1)组织分离：采集野生锥栗菌根菌的子实体；从所述子实体的菌盖与菌柄交汇 处，取菌肉组织块； (2)菌丝培养与提纯：将所述菌肉组织块接种在改良MMN平板培养基上，置于 25~28°C下培养至菌肉组织块萌发出菌丝，将所述菌丝转接至新的改良MMN平板培养基 上，在25~28°C下培养至菌丝长满平板，获得纯化菌丝； (3)液体发酵培养：挑取所述纯化菌丝，接种到改良MMN液体培养基中，在25~ 28°C下振荡培养10~15天，获得菌液； (4)菌种扩大培养：将所述菌液接种到扩大培养料中，在25~28°C下培养至菌丝 长满培养容器，收集所述菌丝，即得。 本专利技术步骤（1)所述采集锥栗菌根菌子实体时，采集中等成熟的子实体并连同子 实体附近土壤及锥栗根系一起采集。 本专利技术步骤⑵所述改良MMN平板培养基的pH值为5-6,包括以下成分： CaCl2O. 04 ~0? 06g，MgSO4O. 12 ~0? 16g，NaCl0? 02 ~0? 03g，浓度为 1 % 的FeCl3L0 ~ I. 5ml，KH2PO4O. 4 ~0? 6g，VitamibB180 ~120yg，KNO3O. 20 ~0? 30g，12Be'的麦芽汁 80~120ml，甘露醇15~20g，柠檬酸0? 15~0.25g，琼脂15~20g，蒸馏水900ml。其中， 各成分的用量可以按照相同的比例扩大或缩小。 所述MMN平板培养基的制作方法具体为：①配制0?08 ~0?12mg/mlVitamibB1，过滤灭菌； ②将琼脂加入蒸馏水中加热溶解，之后加入其余原料，用Imol/LNaoH或lmol/L HCl调节pH值为5~6左右，在121°C下灭菌20min，灭菌后放到无菌操作台，冷却到45~ 55 °C左右，得混合液备用； ③在所述混合液中加入I. Oml步骤①所得过滤灭菌的VitamibBl; ④将步骤③所得液体趁热分装到培养皿中，冷凝，即可。 本专利技术所述步骤（3)中，每100mL液体改良MMN培养基中接种4~6个由所述纯 化菌丝组成的菌饼，每个菌饼直径3~7mm。 所述改良MMN液体培养基的pH值为5-6,包括以下成分=CaCl2O. 04~0.06g， MgSO4O. 12 ~0? 16g，NaCl0? 02 ~0? 03g，浓度为 1 % 的FeCl3L0 ~I. 5ml，KH2PO4O. 4 ~ 0? 6g，VitamibB180 ~120yg，KNO3O. 20 ~0? 30g，12Be' 的麦芽汁 80 ~120ml，甘露醇 15~20g，柠檬酸0. 15~0. 25g，蒸馏水900ml。其中，各成分的用量可以按照相同的比例 扩大或缩小。所述改良MMN液体培养基按照本领域液体培养基的常规配制方法配制。 步骤（3)所述振荡培养的转速优选为50~150r/min，进一步优选为100r/min。 本专利技术所述步骤⑷中，菌液以40~50ml/100g接种到扩大培养料中。 所述扩大培养料中包含草炭土、玉米粉和珍珠岩。具体的，三者的质量比为草炭 土：玉米粉：珍珠岩=6~8 :1~2 :1~2,优选为7:1. 5:1. 5。 本专利技术同时保护所述方法栽培得到的锥栗菌根菌。 本专利技术进一步保护所述锥栗菌根菌在锥栗栽培中的应用。所述应用包括以下步 骤：在锥栗幼苗长出一对真叶时，以8~12g/株的接菌量将所述锥栗菌根菌接种于锥栗幼 苗根部。所述接种量优选为IOg/株。 本专利技术提供的锥栗菌根菌的人工培养方法操作简单，将所述菌根菌回接锥栗幼苗 后，菌根侵染率高，幼苗的苗高高、地径大，同时高径比较小，有助于培育壮苗。本专利技术所得 的锥栗菌根菌可增强锥栗根系对养分的吸收能力，扩大吸收面积，还可分解土壤中难以分 解的养分，土壤干旱时，增强抗旱力，同时分泌激素和有机酸，提高根系的生理活性，具有广 泛的应用价值。【附图说明】图1为实施例1所得锥栗菌根菌在光学显微镜下的形态示意图；图2为实施例1所得锥栗菌根菌在体式显微镜下的形态示意图。【具体实施方式】 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。 本专利技术各实施例中，所述锥栗菌根菌为与锥栗根系共生的橙黄硬皮马勃。 实施例1 一种锥栗菌根菌的人工培养方法，包括以下步骤： (1)野生菌根菌子实体的采集与组织分离： 在30龄的锥栗园林下，采集新鲜、健壮、中等成熟的野生菌根菌子实体及附带土 壤及和锥栗根系，除去表面本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种锥栗优势共生菌根菌的人工培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)组织分离：采集野生的锥栗优势共生菌根菌的子实体；从所述子实体的菌盖与菌柄交汇处，取菌肉组织块；(2)菌丝培养与提纯：将所述菌肉组织块接种在改良MMN平板培养基上，置于25～28℃下培养至菌肉组织块萌发出菌丝，将所述菌丝转接至新的改良MMN平板培养基上，在25～28℃下培养至菌丝长满平板，获得纯化菌丝；(3)液体发酵培养：挑取所述纯化菌丝，接种到改良MMN液体培养基中，在25～28℃下振荡培养10～15天，获得菌液；(4)菌种扩大培养：将所述菌液接种到扩大培养料中，在25～28℃下培养至菌丝长满培养容器，收集所述菌丝，即得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：袁德义，刘冬明，邹锋，朱周俊，张旭辉，谭露曼，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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