本发明专利技术涉及一种克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的制备方法和应用，取带鱼加工副产物，加入磷酸缓冲液和复合水解酶，控制反应条件制得鱼加工副产物蛋白肽水解液，加入金属元素和少量的VC保护，形成螯合反应体系，螯合反应结束后，将离心获得的上清液采用超/纳滤截留获得分子量<1500Da水解肽-金属元素配合物，经真空浓缩、真空冷冻干燥后，得非特异性免疫增强剂。使用时将该非特异性免疫增强剂以800～1500mg/kg的比例加入克氏原鳌虾常规基础营养饲料。该发明专利技术利用带鱼加工副产物作为原料，不仅降低了成本，提高了经济效益，且该制备方法操作简单、易控；该免疫增强剂的应用不仅操作简单，且可使虾体更好地摄入和吸收，从而有效增强虾体的免疫机能，更好地抵御各种鳌虾常见病的侵害。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及水产养殖
，涉及鳌虾等甲壳类水产动物增强机体免疫功能的 方法，尤其涉及。
技术介绍
克氏原螯好（Procambarus clarkii)俗称小龙好，是目前全世界分布最广的淡水 螯虾养殖种类，在我国长江中下游地区均有养殖。克氏原螯虾味道鲜美，磷、钙、铁等元素含 量高，蛋白含量高，而脂肪含量低，具有较高营养和食疗价值，近年来国内外需求量不断上 升，致使其养殖总量也逐年增大，2012年，我国克氏原螯虾总产量为55. 48万吨，比2011年 增加14.09%。近年来，随着现代工业发展，环境污染加剧导致了养殖螯虾虾体免疫机能降 低、生长速度变缓、饵料效率下降及病原体疾病频发等问题。 螯虾等甲壳类水产动物抵御外界胁迫因子的最好方法是增强动物机体的免疫功 能，如申请号为201310406260. 4 (申请公告号为CN103431244A)的中国专利技术专利《一种提供 克氏原鳌虾幼虾免疫力的维生素饲料及添加剂》公开了一种维生素饲料，该饲料包括如下 按质量百分比计的组分：小麦粉10-30%，玉米粉10-20%，矿物质1-2%，鱼粉10-30%，黄豆粉 30-50%，鱼油 1-3%，维生素 A0. 0048-0. 0060%，维生素 C0. 02-0. 08%，维生素 E0. 02-. 0. 06%， 余量为糊精。该饲料及添加剂能提高克氏原鳌虾幼虾的成活率、体重增长率及腮中酚氧化 酶的活性，并降低虾肝胰腺中MDA含量，提高其免疫力。 然而，由于鳌虾等甲壳类水产动物的体液中不具有免疫球蛋白，因而其免疫主要 为非特异性免疫。蛋白水解肽可与机体必需微量金属元素结合，形成蛋白肽-金属配合物 (有机金属化合物)，其在提高生物体的生长繁殖、增强抗病免疫力、调节生理代谢等方面都 有重要生理作用。Gelinsky等制备了谷胱甘肽及其衍生肽与Zn 2+的配合物，并证实螯合制 备的蛋白肽-Zn2+配合物可满足人体对谷胱甘肽的需求。郭存荣等将蛋白肽-Zn 2+配合物进 行罗非鱼养殖试验，发现饲料中添加该配合物显著提高了罗非鱼的生长性能、饲料利用率、 血清溶菌酶及S0D活力。Deng等以低值鱼类为原料，经酶解、金属螯合制备了蛋白肽-Fe 2+ 配合物，经研究发现制备的配合物具有较强抗氧化和清除自由基活性。目前，关于带鱼加工 副产物水解肽-金属配合物，对于克氏原螯虾等甲壳类水产动物生长及非特异性免疫的影 响研究，尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种利用蛋白水解肽-金属 配合物的克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的制备方法。 本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供一种上述克氏原鳌虾非特异性免疫增 强剂在增强克氏原鳌虾非特异性免疫方面的应用。 本专利技术解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种克氏原鳌虾非特异性免疫 增强剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1)取带鱼加工副产物，加入磷酸缓冲液，40~50°C保温10~15min，接着经组 织打碎、超声处理后，加入2~8g/L复合水解酶，控制温度为水浴恒温37~60°C，水解度 为20~30%，前述磷酸缓冲液的浓度为0. 05~0. 20mol/L，pH值为6. 8~7. 6,磷酸缓冲 液与带鱼加工副产物的体积比为4~6:1，前述复合水解酶为质量比为1~3:1:1的风味 蛋白酶、木瓜蛋白酶以及碱性蛋白酶的混合物，前述超声波处理条件为25~40KHZ，时间为 L 0 ~4. Omin ; (2)继续升温至85~95°C，保持2. 0~3. Omin后，冰浴快速冷却至0~4°C， 3000~4500r/min离心分离10~20min获得上清液，即为带鱼加工副产物蛋白肽水解液； (3)调节上述获得的带鱼加工副产物蛋白肽水解液pH值至6. 9~7. 1，加入终浓 度为1. 0~3. Og/L的金属元素，同时加入少量的Ve保护，形成螯合反应体系，调节螯合反 应体系pH为4. 0~7. 0,在20~35°C恒温条件下进行水浴振荡，螯合反应20~40min，前 述金属元素为Fe2+、Ca 2+、Zn2+中的一种或几种混合物； (4)螯合反应结束后，8000~10000r/min离心分离15~25min，将获得的上清液 采用超/纳滤截留获得分子量<1500Da水解肽-金属元素配合物，经真空浓缩、真空冷冻干 燥后，得带鱼加工副产物蛋白水解肽-金属元素配合物，即非特异性免疫增强剂。 本专利技术解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种如权利要求1所述的克氏 原鳌虾非特异性免疫增强剂的应用，其特征在于：所述非特异性免疫增强剂在提高克氏原 鳌虾免疫指标的应用。 所述氏原鳌虾免疫指标包括血清以及肝胰腺组织中S0D、P0、LSZ和ACP酶活力，其 中S0D (超氧化物歧化酶)是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清楚自由基的首要物质， 可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的 对细胞伤害；P0 (过氧化物酶)主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化 过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用；LSZ (溶 菌酶)主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的0-1，4糖苷键， 使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，内容物逸出而使细菌溶解，还 可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活，具有抗 菌、消炎、抗病毒等作用；ACP(酸性磷酸酶）主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内。 本专利技术中该非特异性免疫增强剂在克氏原鳌虾饲养中的具体应用为：在克氏原鳌 虾常规基础营养饲料中，以800~1500mg/kg的比例加入所述非特异性免疫增强剂，作为克 氏原鳌虾日常饲喂饵料，通过混加入克氏原鳌虾常规饲料的方式应用该非特异性免疫增强 剂，不仅操作简单，并且可使虾体更好地摄入和吸收，从而有效增强虾体的免疫机能，更好 地抵御各种鳌虾常见病的侵害。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于：利用带鱼加工副产物(如鱼头、鱼骨、碎肉 等）获取蛋白水解肽，再利用螯合反应结合金属元素制备出具有增强克氏原鳌虾免疫功能 的蛋白水解肽-金属元素配合物。该专利技术利用带鱼加工副产物作为原料，不仅降低了成本， 提高了经济效益，而且减少了带鱼加工产业对环境的污染，并且该制备方法操作简单、易 控，产物得率高；同时该专利技术中通过添加如鳌虾常规饲料的方式将非特异性免疫增强剂应 用于克氏原鳌虾饲养中，不仅操作简单，可使虾体更好地摄入和吸收，从而有效增强虾体的 免疫机能，更好地抵御各种鳌虾常见病的侵害。【具体实施方式】 以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。 实施例1 : 取带鱼加工副产物400g，加入1600ml磷酸缓冲液（0? lmol/L，pH7. 5)，45°C保温 lOmin，接着组织打碎2. 0min，30KHz超声处理2. Omin，加入12g复合酶（风味蛋白酶、木瓜 蛋白酶及碱性蛋白酶三者复合比例为1 : 1 : 1)，将该混合体系置于45°C恒温水浴振荡器 中，100以1^11充分酶解，控制水解度达到20%后，升温至901：，保持2.0111111后，冰本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）取带鱼加工副产物，加入磷酸缓冲液，40～50℃保温10～15min，接着经组织打碎、超声处理后，加入2～8g/L复合水解酶，控制温度为水浴恒温37～60℃，水解度为20～30%，前述磷酸缓冲液的浓度为0.05～0.20mol/L，pH值为6.8～7.6，磷酸缓冲液与带鱼加工副产物的体积比为4～6:1，前述复合水解酶为质量比为1～3:1:1的风味蛋白酶、木瓜蛋白酶以及碱性蛋白酶的混合物，前述超声波处理条件为25～40KHZ，时间为1.0～4.0min；（2）继续升温至85～95℃，保持2.0～3.0min后，冰浴快速冷却至0～4℃，3000～4500r/min离心分离10～20min获得上清液，即为带鱼加工副产物蛋白肽水解液；（3）调节上述获得的带鱼加工副产物蛋白肽水解液pH值至6.9～7.1，加入终浓度为1.0～3.0g/L的金属元素，同时加入少量的VC保护，形成螯合反应体系，调节螯合反应体系pH为4.0～7.0，在20～35℃恒温条件下进行水浴振荡，螯合反应20～40min，前述金属元素为Fe2+、Ca2+、Zn2+中的一种或几种混合物；（4）螯合反应结束后，8000～10000r/min离心分离15～25min，将获得的上清液采用超/纳滤截留获得分子量<1500Da水解肽‑金属元素配合物，经真空浓缩、真空冷冻干燥后，得带鱼加工副产物蛋白水解肽‑金属元素配合物，即非特异性免疫增强剂。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张宾，史周荣，王晓玲，邓尚贵，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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