本发明专利技术涉及一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，包括反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、无热源水、标准品及质控品，反应主剂以鲎血细胞为主要原料，含有G因子、凝固酶、凝固酶原及多肽显色基质，其中多肽显色基质为Gly-Arg末端连接PNA的合成三肽或四肽，通过采用凝固酶酶切此种多肽显色基质，产生游离的对硝基苯胺(PNA)后，用酶标仪直接进行检测，缩短了检测路线，降低了成本，由于酶标仪进行速率法酶动力学检测法，相对浊度法检测法，灵敏度更高，而且反应主剂不易受到体液标本中蛋白及药物的干扰产生非特异性浊度，使本发明专利技术的检测结果假阳性的概率降低，检测准确度更高。
【技术实现步骤摘要】
一种人体液的显色法真菌1,3-β-D-葡聚糖检测试剂盒
本专利技术涉及一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒。技术背景近年来，原发性和继发性侵袭性真菌感染(invasivefungalinfections，IFI)的患病率持续上升。IFI作为院内感染在恶性肿瘤患者、接受化疗的血液病患者、AIDS患者、器官移植患者和接受抑制免疫力治疗的患者中十分常见，致使越来越多的患者产生严重的并发症甚至死亡。许多真菌疾病是由于吸入污染物、植物碎屑、空气中或暴露表面的真菌孢子引起，另有一些常见真菌存在于人类皮肤、肠道和粘膜中也可作为致病菌造成感染。目前侵袭性真菌感染和真菌血症的诊断通常采用非特异性诊断或者放射学技术，阳性率低，检测周期长，不能及时的为临床提供诊断依据。1，3-β-D葡聚糖是酵母和丝状真菌细胞壁的多聚糖成分，而原核生物、病毒和人体细胞都不存在这种多聚糖，当真菌进入人体血液或深部组织后，经中性粒细胞及吞噬细胞的处理，1，3-β-D-葡聚糖可从真菌细胞壁释放出来进入血液及其他体液中，在浅部真菌感染中，1，3-β-D-葡聚糖未被释放出来，故在体液中的量不增高。因此，1，3-β-D-葡聚糖在血液及无菌体液中的含量成为侵袭性真菌感染诊断标准。通常人原发性真菌病原体有念珠菌属和曲霉菌属，继发性真菌病原体包括梭霉菌属、梭霉菌属、酿酒酵母、支顶孢属、粗球孢子菌、夹膜组织胞浆菌、卡氏肺孢子菌等。1，3-β-D-葡聚糖都存在于这些真菌的细胞壁中，因此，通过检测人体液中1，3-β-D-葡聚糖含量即可有效的筛查侵袭性真菌感染。目前中、美、日三国基于鲎的血凝集反应原理，利用鲎的血细胞裂解物，通过一系列酶反应来实现1，3-β-D-葡聚糖检测。鲎血液包含两类细胞，其中一类为颗粒细胞(granμLarhemocyte或granμLocyte)或称之为变形细胞(amebactye)，成年鲎只含有这类细胞。鲎血液凝集与哺乳动物的血液凝集相似，是一系列级联酶反应。1981年，Morta从鲎血变形细胞中分离出一种酶，成为G因子，同年日本学者kakinuma等证明霉菌细胞壁中普遍存在CMPS，它可活化G因子，活化G因子又可使凝固酶产生凝集反应，从而证明了鲎试剂凝集反应的一条途径，即在G因子和凝固酶原的存在下，可与CMPS类物质产生凝集作用，可用于临床1，3-β-D-葡聚糖检测。公布日为2012年1月4日，公布号为102305787的中国专利技术专利申请《真菌(1-3)-β-D葡聚糖比色检测试剂盒的制备及其使用方法》公开了一种通过利用(1-3)-β-D葡聚糖来激活鲎血G因子，进一步水解显色基质后，通过分光光度计进行吸光度检测来达到检测(1-3)-β-D葡聚糖的目的。该方法的问题在于所需配置显色试剂较多，操作繁琐，且中间过程中容易有外界细菌污染介入，影响检测结果。公告日为2013年1月9日，公布号为102866255的中国专利技术专利申请《一种人体液真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测试剂盒及其应用方法》公开了一种通过利用传统的鲎试剂制备方法制备，浊度法检测真菌(1，3)-β-D葡聚糖的试剂盒。此真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测试剂盒所依据的浊度法检测灵敏度较低，另外反应主剂易受到体液标本中蛋白及药物的干扰产生非特异性浊度，从而使检测结果假阳性升高，检测准确度较低。专利201010221407.9提供了一种直接真菌检测鲎试剂盒及方法，所述试剂盒组成包括：(1)G试剂：为鲎血球细胞溶解物与发色物质的混合物；(2)缓冲液：0.02～0.1mol/LTris-HCl；(3)标准品：(1-3)-β-D-葡聚糖；(4)重氮化试剂；(5)血液处理液。通过对样品、标准品进行处理，配制G试剂溶液，分装、加温、终止，然后测定吸光值，作出标准曲线，计算样品中的(1-3)-β-D-葡聚糖含量。该试剂盒能快速、准确地定量人体血液及体液标本中的微量(1-3)-β-D-葡聚糖，此专利中发色物质为Boc-LGR-pNA，使用重氮化试剂将反应终止后，终点法检测吸光度，此设计检测步骤线路长，引入干扰物的几率大，使得检测时间延长，灵敏度较差。
技术实现思路
本专利技术为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种操作简单、设计合理、检测快速、准确度高的一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒及其应用方法。本专利技术为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于包括：反应主剂；主剂复溶液：0.01-1mol/mLTris-HCl缓冲液和0.01-0.3mol/mLMg2+；样本处理液：o.5M-2mol/mLKCl和0.05M-0.5mol/mLKOH；无热源水；标准品；质控品；所述反应主剂以鲎血细胞为主要原料，含有G因子、凝固酶、凝固酶原及多肽显色基质。所述反应主剂的制备方法包括以下步骤：1)采血与分离细胞：将活体鲎清洗，使用酒精或碘酒将心门消毒，使用无热原不锈钢针采血，600-1500rpm离心，去除上清液，收集鲎血细胞；2)裂解：向步骤1)收集的鲎血细胞中加入加入裂解液重悬细胞，加入裂解液和鲎血细胞的体积比1∶2-9∶10，-20℃冷冻12小时以上，然后解冻，解冻后即得鲎血细胞溶解物；3)提取分离：向步骤2)制得的鲎血细胞溶解物中加入氯仿，加入氯仿与鲎血细胞溶解物的体积比1∶0.5-1∶1，搅拌混合5-20分钟，4℃，6000-8000rpm下离心20-30分钟，取上清液；4)制剂：向步骤3)制得的上清液中加入B、C因子抑制剂和多肽显色基质，使每毫升上清液中B、C因子抑制剂含量为0.5-3mg，多肽显色基质0.5-2mg，冰浴搅拌3-5min；所述B、C因子抑制剂为对B、C因子特异性相对较高的丝氨酸蛋白抑制剂，所述多肽显色基质为Gly-Arg末端连接PNA的合成三肽或四肽；5)真空冷冻干燥：将步骤4)得到的液体分装至西林瓶或安瓿瓶中，真空冷冻干燥，得到反应主剂。所述多肽显色基质为Boc-Leu-Gly-Arg-PNA或Boc-Ile-Gly-Arg-PNA。所述样本处理液的制备方法，采用无热源水配制0.05mol-0.5mol/mLKOH和0.5mol-2mol/mLKCl，使用时将已配制的两种溶液等体积混合即为样本处理液。所述主剂复溶液的制备方法，按处方用显分别称取Tris-HCl和MgCl2，置投料容器内，添加无热源水至配制量，使得每毫升溶液含Tris-HCl0.01-1mol和MgCl20.01-0.3mol，混合均匀后，用稀盐酸调pH，过滤分装。所述主剂复溶液的pH值在6.0-8.0之间。所述无热源水为无菌无热原水。所述标准品的制备方法为1，3-β-D-葡聚糖标准品与1-8％(重量比)的赋形剂混合，40℃～55℃冷冻5h，真空冻干，制得。所述质控品的制备方法，1，3-β-D-葡聚糖标准品与为10％(重量比)的小牛血清及1-8％(重量比)的赋形剂混合，零下40℃～55℃冻干，封口即得成品。一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的检测方法，鲎血细胞中G因子被待检测样本中1，3-β-D-葡聚糖激活，形成活化G因子，活化G因子使凝固酶原转化为凝固酶，凝固酶酶切多肽显色基质产生游离的对本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人体液的显色法真菌1，3‑β‑D‑葡聚糖检测试剂盒，其特征在于包括：反应主剂；主剂复溶液：0.01‑1mol/mL Tris‑HCl缓冲液和0.01‑0.3mol/mL Mg2+：样本处理液：0.5M‑2mol/mL KCl和0.05M‑0.5mol/mL KOH；无热源水；标准品；质控品；所述反应主剂以鲎血细胞为主要原料，含有G因子、凝固酶、凝固酶原及多肽显色基质。
【技术特征摘要】
1.一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，其特征在于包括：反应主剂；主剂复溶液：0.01-1mol/mLTris-HCl缓冲液和0.01-0.3mol/mLMg2+；样本处理液：0.5-2mol/mLKCl和0.05-0.5mol/mLKOH；无热源水；标准品；质控品；所述反应主剂以鲎血细胞为主要原料，含有G因子、凝固酶、凝固酶原及多肽显色基质；所述反应主剂的制备方法包括以下步骤：1)采血与分离细胞：将活体鲎清洗，使用酒精或碘酒将心门消毒，使用无热原不锈钢针采血，600-1500rpm离心，去除上清液，收集鲎血细胞；2)裂解：向步骤1)收集的鲎血细胞中加入裂解液重悬细胞，加入裂解液和鲎血细胞的体积比1∶2-9∶10，-20℃冷冻12小时以上，然后解冻，解冻后即得鲎血细胞溶解物；3)提取分离：向步骤2)制得的鲎血细胞溶解物中加入氯仿，加入氯仿与鲎血细胞溶解物的体积比1∶0.5-1∶1，搅拌混合5-20分钟，4℃，6000-8000rpm下离心20-30分钟，取上清液；4)制剂：向步骤3)制得的上清液中加入B、C因子抑制剂和多肽显色基质，使每毫升上清液中B、C因子抑制剂含量为0.5-3mg，多肽显色基质0.5-2mg，冰浴搅拌3-5min；所述B、C因子抑制剂为对B、C因子特异性相对较高的丝氨酸蛋白抑制剂，所述多肽显色基质为Gly-Arg末端连接PNA的合成三肽或四肽；5)真空冷冻干燥：将步骤4)得到的液体分装至西林瓶或安瓿瓶中，真空冷冻干燥，得到反应主剂；所述多肽显色基质为Boc-Leu-Gly-Arg-PNA或Boc-Ile-Gly-Arg-PNA；所述样本处理液的制备方法，采用无热源水配制0.05-0.5mol/mLKOH和0.5-2mol/mLKCl，使用时将已配制的两种溶液等体积混合即为样本...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋禹，王保学，李宁，王东东，栗艳，周泽奇，
申请(专利权)人：天津汇滨生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。