本发明专利技术涉及表皮生长因子受体(EGFR)与蛋白酶活化受体2(PAR2)对肠道通透性的调节。进一步地，本发明专利技术提供了一种治疗自身免疫性疾病的方法，其步骤包括增加跨越表皮细胞的电阻，以导致细胞通透性的减少。此发明专利技术也提供了一种治疗人类乳糜泻病的方法，其步骤包括给予单链连蛋白的抗体，以抑制表皮生长因子受体和PAR2。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】表皮生长因子受体（EGFR)与蛋白酶活化受体2(PAR2)对肠 道通透性的调节 本申请是申请号为201080031880. 9,申请日为2010年6月10日，专利技术名称为"表 皮生长因子受体（EGFR)与蛋白酶活化受体2(PAR2)对肠道通透性的调节"的中国专利申请 的分案申请。 联邦基金注释 本专利技术自国立卫生研宄院获得的基金（基金号DK048373)在政府支持下完成。政 府对此专利技术具有一定权利。 相关申请的夺叉索引 根据U.S.C. 35第119(e)条，本国际专利申请案要求享有2009年6月10日归档 的现已终止的美国临时专利申请第61/185, 662号的优先权，并且上述专利申请案的内容 以引用的方式合并于此。
本专利技术涉及细胞生物学和肠道通透性领域。更为具体地，本专利技术涉及表皮生长因 子受体（EGFR)与蛋白酶活化受体2 (PAR2)对肠道通透性的调节。
技术介绍
卫生水平的提高而导致的与各种微生物接触的减少，被认为是过去三四十年里工 业化国家中，造成有记录的过敏、炎症和自身免疫症等流行病的原因之一（1)。除了遗传体 征和与环境因素的接触外，第三类重要因素，例如增加的肠道通透性（IP)，被认为是这些疾 病的致病原因（2 - 4)。 肠道通透性与肠上皮细胞和肠内腔树突状细胞进行的抗原摄取共同调节肠腔与 黏膜下层间的分子运输，导致对非自体抗原的免疫或耐受（5)。然而，胞旁空间的尺寸（10 到15埃）表明分子半径大于15埃（分子量约3. 5kDa，包括蛋白质）的溶质通常被排阻在 这种摄取途径之外。细胞间紧密连接严密地调节这种胞旁抗原运输。 紧密连接是在生理和病理环境下都对肠上皮的多种重要功能有操控作用的动态 结构（3)。然而，尽管对于细胞间紧密连接组成和功能上的了解有了很大进展，其调控机理 尚不完全清楚。 一种能够增加紧密连接通透性的毒素一一霍乱弧菌闭合带毒素（Zot)的发现，导 致了对于其真核细胞对应物--连蛋白（zonulin)的确认。连蛋白是已知的唯一一种能 够通过调节细胞间紧密连接来可逆地调控小肠通透性的调节物（6,7)。人连蛋白是约为 47kDa的蛋白，能够增加非人灵长目动物肠上皮的肠道通透性（7)，参与肠道天然免疫（8)， 并在紧密连接功能障碍居核心地位的自身免疫紊乱疾病，如乳糜泻（CD) (9，10)和一型糖 尿病（11)中，高量表达。 触珠蛋白是一种急性时相反应蛋白，主要在肝脏、动脉壁、子宫内膜和腹膜合成。 触珠蛋白的核心功能是作为血红蛋白（Hb)的结合蛋白，参与大部分在肝脏网状内皮系统 中的，游离血红蛋白的终末过程和清除。该系统使血红蛋白基元中的铁得以保持。 触珠蛋白具有由二硫键连接的两条a -链和两条0 -链组成的四聚体结构。0 -链 (245个氨基酸）的分子量约为40kDa(约30%的质量为糖类），为所有表现型所共有。a-链 存在两种形式：a-1(83个氨基酸，9kDa)和a-2 (142个氨基酸，17. 3kDa)。因此触珠蛋白 具有三种表现型：Hpl-1，Hp2_l和Hp2_2。Hpl-1包含两条a -1链，Hp2_2包含两条a -2 链，Hp2_l包含一条a-1链和一条a-2链。Hpl-1的分子量为lOOkDa，与血红蛋白结合 时分子量为165kDa。Hpl-1以单体异构体存在，也被称为Hp二体。Hp2-1的平均分子量为 220kDa，形成线性多聚体。Hp2-2的平均分子量为400kDa，形成环状多聚体。每种不同的多 聚体形态均为一种不同的异构体。触珠蛋白作为一种潜在治疗手段可用于溶血造成的肾脏损害。治疗上的潜在作用 主要表现于作为一种清除游离血红蛋白的手段，其形成的复合物还具有潜在的抗炎症、抗 氧化及血管生成剂的作用。然而，触珠蛋白被认为难于在保持其生物活性的同时进行大规 模分离。 对于触珠蛋白前体2功能的阐释以及其调节肠道通透性的方法有着广泛的需求。 本专利技术将填补这些方面的长期空白。
技术实现思路
虽然连蛋白在健康和疾病中作为肠道通透性调节物的角色已有了功能性的描述， 但其生化特性尚不清楚。本专利技术显示，通过对人血清的蛋白质组分析，连蛋白等同于触珠蛋 白前体2 (HP2)。该分子先前只被认为是触珠蛋白的无活性前体，与HP1 -样，是人触珠蛋白 前体的两种遗传突变体之一。本专利技术展示了作为触珠蛋白前体2的连蛋白的功能性描述。 其作为一个多功能蛋白，以完整的单链前体形式，通过蛋白酶活化受体2(PAR2)的活化，反 式激活表皮生长因子受体（EGFR)，来调节肠道通透性，而且被剪切后的双链形式则作为血 红蛋白的清道夫。 因此，在本专利技术的一部分实施例中，提供了治疗一种自身免疫疾病的方法，由增加 跨表皮细胞电阻，以导致细胞通透性减少的步骤组成。 在本专利技术的另一部分实施例中，提供了对于一个病患个体用此种手段进行自身免 疫疾病治疗的方法，由抑制表皮生长因子受体和抑制蛋白酶活化受体2的步骤组成。 在本专利技术的另一部分实施例中，提供了对于一个病患个体用此种手段进行乳糜泻 治疗的方法，包括了给予单链连蛋白的抗体，由此抑制表皮生长因子受体和抑制蛋白酶活 化受体2的步骤。 以专利信息公开为目的，本专利技术其他和进一步的方面、特点和优势将在后文中首 选的实施例部分的描述中呈现。【附图说明】 因此，上述特点、优势、专利技术的对象以及其他将明确的内容，会被涉及到并且在细 节层面上也可以被理解，在附图中，将对以上简述的专利技术的某些部分和更具体的描述加以 图示。这些附图形成具体阐释的一部分。然而需要注意的是，附图只图示专利技术的首选部分， 因此并不仅限于此范围。 图1显示用连蛋白交叉反应的抗连蛋白多克隆抗体对去除了白蛋白和免疫球蛋 白IgG的乳糜泻病人血清进行的免疫印记。检测到三个主要的条带式样：显示一条18kDa 免疫反应条带和一条较模糊的45kDa条带的血清（列1)，只显示一条9kDa条带的血清（列 2)，和显示18kDa和9kDa条带的血清（列3)。 图2A-2B显示纯化的人纯合HP1-1和HP2-2未经和经过肽N-糖苷酶（PGNase)去 糖基化处理的考马斯染色和免疫印记。图2A :未经去糖基化处理的触珠蛋白考马斯染色显 示共同的糖基化的0链迀移至分子量约52kDa处，而HP1-1的a链（a 1)和HP2-2的a 链（a 2)各自迀移到预期的分子量，8kDa和18kDa处。肽N-糖苷酶去糖基化造成0链位 移至分子量约36kDa处（完全去糖基化）或稍高的分子量处（不完全去糖基化）。与预期相 一致，非糖基化的a 1和a 2链没有观察到位移变化。图2B :纯化的人纯合HP1-1和HP2-2 未经和经过肽N-糖苷酶去糖基化处理的免疫印记，同一凝胶上对三个平行样品进行电泳， 转膜，然后分别用多克隆抗Zot抗体（左列），单克隆抗HP抗体（中间列）或多克隆抗HP 抗体（右列）进行免疫印记。三种用于检测的抗体都能识别al和a2链（所有栏中，列1 和列2)，它们的条带式样在对HP1-1和HP2-2蛋白进行去糖基化处理后没有发生变化（列 3和列4)。相反地，通过抗HP单克隆抗体（中间栏，列3和列4)或抗HP多克隆抗体（右 栏，列3和列4)检测，去糖基化造成HP1-1和HP2-2 0链预期的胶迀移位移。连蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种治疗自身免疫性疾病的方法，其包括步骤：增加跨上皮电阻，导致细胞通透性的降低。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·法萨诺，K·拉默斯，T·谢伊多诺霍，S·戈德布卢姆，
申请(专利权)人：马里兰巴尔的摩大学，
类型：发明
国别省市：美国;US
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