一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及疾病动物模型构建方法技术领域，本发明专利技术提供了一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法，该方法不破坏黄韧带的完整性，将药物与matrigel相混合后多点注入黄韧带中，最大程度的延长了药物与黄韧带相作用的时间，并扩大了药物与黄韧带的接触面积。本发明专利技术制备的动物模型更接近人体内黄韧带骨化的发生机制，而减少破坏黄韧带的完整性，提高建立模型的成功率，对将来研究人体内黄韧带骨化发生机制提供一定的理论基础，从而更好的应用于临床。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及疾病动物模型构建方法
，具体涉及一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法。
技术介绍
：黄韧带骨化症(Ossification of ligamentum flavum,OLF)，是一种发生在人脊柱黄韧带的异位骨化症，该病变可以造成脊髓后方的压迫，引起四肢瘫痪、大小便功能障。OLF的发病机制目前尚不清楚，当前关于黄韧带骨化症发病机制的实验研究对象主要以人黄韧带细胞为主，而动物模型作为验证体外细胞学实验结果和疾病机制的重要手段，对OLF研究较少。黄韧带骨化症的发生是一个多因素致病过程，根据现有的文献报道，黄韧带骨化动物模型主要通过黄韧带局部干预法(Mimatsu K,Kishi S,Hashizume Y.Experimental chronic compression on the spinal cord of the rabbit by ectopic bone formation in the ligamentum flavum with bone morphogenetic protein.Spinal Cord.1997；35(11):740-6.)和基因改造(Uchida K1,Nakajima H,Watanabe S,et al.Apoptosis of neurons and oligodendrocytes in the spinal cord of spinal hyperostotic mouse(twy/twy):possible pathomechanism of human cervical compressive myelopathy.Eur Spine J.2012；21(3):490-7.)的方法建立，其中黄韧带局部干预法是目前建立黄韧带骨化模型的主要方式。本专利技术人所在的课题组前期试验取新西兰大白兔作为实验对象，将明胶海绵作为BMP诱导骨化的载体，每侧植入物中含rhBMP 0.1mg，诱导黄韧带骨化成功，相关研究成果参见以下论文(陈雄生,贾连顺,倪斌,袁文,陈华江,李玉莉.重组人骨形态发生蛋白2诱发黄韧带骨化的病理学研究.第二军医大学学报,2000；21(7):642-644。陈雄生,贾连顺,倪斌,孔庆毅,徐爱民,陈华江,李玉莉.重组人骨形态发生蛋白-2诱发黄韧带骨化的实验模型.中国脊柱脊髓杂志,2002；12(1):31-34)新西兰大白兔是建立动物模型应用较多的动物，其黄韧带的暴露相对 比较容易，解剖结构的研究也非常明确。以往建立兔黄韧带骨化模型，术中需要将大部分的黄韧带破坏掉，仅残留靠近硬脊膜后方的一薄层黄韧带，然后将实验所用的药物和载体植入到去除黄韧带的部位，然后用游离肌肉覆盖。该方法的主要缺陷是：1、黄韧带结构破坏过多，黄韧带骨化过程与人黄韧带骨化症发病机制不相符合；2、兔大部分的黄韧带已被破坏，标本量大量减少，阳性结果较难得到；3、兔黄韧带结构小，在黄韧带内甚至椎管内包埋诱导骨化药物，很容易造成脊髓的损伤，操作上难度较大；4、药物与黄韧带的接触面积较局限；5、载体以胶原蛋白和明胶海绵为主，干预药物容易流失。上述缺陷致使黄韧带骨化动物模型成功率也较低，克服或改善上述缺陷是提高黄韧带骨化症动物模型构建成功率的关键。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种克服上述缺点，提高黄韧带骨化症动物模型构建成功率的动物模型构建方法。本专利技术提供一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法，该方法具体是一种注射器注射法建立黄韧带骨化模型和药物与matrigel相混合后注入黄韧带的方法。本专利技术的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法，包括以下步骤组成：A、药物与matrigel胶相混合； B、选取3月兔龄的健康成年新西兰大白兔，暴露其黄韧带；将步骤A获得混合后药物用注射器多点注射入黄韧带中。所述的步骤A中，所述的药物为致骨化药物，优选为骨桥蛋白(OPN)、重组人骨形态发生蛋白2等；所述的药物的浓度可根据模型需要调节，药物浓度为1--50ng/μl；骨桥蛋白较优为20ng/μl(相对于药物与matrigel胶混合物的重量体积比)。所述的步骤A国，matrigel胶优选BD公司,其中含层粘连蛋白60％、Ⅳ型胶原蛋白30％、8％巢蛋白以及少量生长因子；所述的步骤A中，较优的为，混合在冰浴上进行，抽取一定量的matrigel与药物相混合，充分吹打混匀，避免气泡的出现。混合后将含有药物的matrigel放入4℃冰箱中保存。所述的步骤B中，较优的为，沿棘突、椎板骨膜下剥离棘旁肌群，切除L5-7棘突间韧带，显露相应节段的黄韧带，保留黄韧带表面的筋膜组织。所述的步骤B，较优的为，用一次性注射器将步骤A获得混合后药物用注射器多点注射入黄韧带中，多点注射指不少于注射点不少于4点，每点注射8μl，总计注射40μl量为宜，注射深度以保留matrigel于黄韧带内部为宜。本专利技术的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法，在黄韧带骨化模型建立过程中不破坏黄韧带的完整性；由于药物的注入形式是以药物与matrigel相混合的方法，最大程度的延长了药物与黄韧带相作用的时间；另外，通过注射器相黄韧带内多点注射含有药物的matrigel，最大限度的扩大了药物与黄韧带的接触面积。本专利技术构建方法的优点在于：1、操作方便，对黄韧带破坏小，保留了黄韧带的完整性；2、采用多点注射，最大限度的增加了药物与黄韧带的接触面积；3、选取matrigel作为干预药物的载体，其冰浴(4℃)下为液态，常温下为胶体，因此可用于注射，并且注入的matrigel成为胶体，药物在黄韧带内能够维持一定的浓度，并且与黄韧带的作用时间会大大延长；4、不容易碰到硬脊膜，很少发生因手术操作而发生脊髓损伤，导致动物瘫痪。本专利技术制备的动物模型更接近人体内黄韧带骨化的发生机制，而减少破坏黄韧带的完整性，提高建立模型的成功率，对将来研究人体内黄韧带骨化发生机制提供一定的理论基础，从而更好的应用于临床。附图说明：图1为本专利技术的新西兰大白兔OLF动物模型建立过程，其中a为黄韧带的显露，箭头所指为黄韧带和两侧黄韧带之间的间隙；b为药物-matrigel多点注射。图2为本专利技术的新西兰大白兔OLF动物模型黄韧带大体标本及Micro-CT检查：术后8周开始影像学开始发现黄韧带骨化，大体标本见黄韧带明显增厚，内部含骨化组织(图2a黑色箭头)，而相邻节段未见黄韧带明显增厚骨化(图2a白色箭头)。Micro-CT检查见横断面局部骨化(图2b白色箭头)，三维重建呈蜂窝状(图2c白色箭头)。术后12周三维重建可见黄韧带大块骨化组织形成(图2f白色箭头)，横断面可见片状骨化组织形成(图2e白色箭头)。而术后12周对照组未见明显骨化组织形成(图2d白色箭头)。图3为本专利技术的新西兰大白兔OLF动物模型骨化黄韧带组织学检查，其中术后8周HE染色可见黄韧带内可见软骨细胞形成(图3a)，甲苯胺蓝染色阳性表现(图3b)；术后12周HE染色可见骨组织形成(图3c)，甲苯胺蓝染色无明显阳性表现(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法，包括以下步骤组成：A、药物与matrigel胶相混合；B、选取3月兔龄的健康成年新西兰大白兔，暴露其黄韧带；将步骤A获得混合后药物用注射器多点注射入黄韧带中。

【技术特征摘要】
1.一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法，包括以下步骤组成：
A、药物与matrigel胶相混合；
B、选取3月兔龄的健康成年新西兰大白兔，暴露其黄韧带；将步骤A获
得混合后药物用注射器多点注射入黄韧带中。
2.根据权利要求1所述的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法，其特征
在于，所述的步骤A中，所述的药物为骨桥蛋白、重组人骨形态发生蛋白
2。
3.根据权利要求1所述的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法，其特征
在于，所述的药物浓度为1--50ng/μl。
4.根据权利要求1所述的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法，其特征
在于，所述的药物为骨桥蛋白，浓度为20ng/μl。
5.根据权利要求1所述的一种黄韧带骨化症动物模型的构建方法，其特征
在于，所述的步骤A中，药物与matrigel胶的混合在冰浴上进行，抽...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雄生，周盛源，刘晓东，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31