TAL介导的转移DNA插入制造技术

本发明专利技术涉及将所要多核苷酸稳定整合到植物基因组中的方法，其包含用包含编码TAL蛋白质的核苷酸序列的第一载体转化植物材料，所述核苷酸序列经设计以识别目标序列；用第二载体转化所述植物材料，所述第二载体包含(i)标记基因，其未可操作地连接于启动子(“无启动子的标记盒”)且其包含与所述目标序列同源的序列；以及(ii)所要多核苷酸；以及鉴别所述所要多核苷酸经稳定整合的经转化植物材料。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 本申请案要求2013年3月15日提交的美国临时申请案第61/790434号和2012 年11月20日提交的的美国临时申请案第61/728466号的优先权，所述申请案的全文通过 引用并入本文中。
本专利技术涉及植物生物
并且提供靶向转移DNA插入以制造具有所要性质 的植物和植物产品的方法。
技术介绍
可以通过将DNA区段插入到植物的基因组中对植物进行修饰。添加的DNA包含重 新排列以产生编码蛋白质或触发特定原生RNA分解的RNA的遗传元件。现有技术教示多种 产生非靶向（不可预测并且随机）插入的次优方法。 所属领域需要高效并且可重现的制造具有所要性质的基因工程改造植物和植物 产品。与采用转基因性质有关的挑战令人不安，尤其是因为通过习知育种不能有效地解决 重要质量问题。
技术实现思路
本专利技术的一个方面是一种将所要多核苷酸稳定整合到植物基因组中的方法，其包 含： (A)用包含编码TAL蛋白质的核苷酸序列的第一载体转化植物材料，所述核苷酸 序列经设计以识别目标序列； (B)用第二载体转化所述植物材料，所述第二载体包含（i)标记基因，其未可操作 地连接于启动子（"无启动子的标记盒"）且其包含与所述目标序列同源的序列；以及（ii) 所要多核苷酸；以及 (C)鉴别所要多核苷酸经稳定整合的经转化植物材料。 在一个实施例中，经转化植物材料暴露于反映经转化植物中存在或不存在标记基 因的条件。在另一实施例中，标记基因为耐除草剂基因且经转化植物材料暴露于除草剂。在 一个实施例中，耐除草剂基因为ALS基因。在另一实施例中，无启动子的标记盒稳定整合到 植物基因组中。 在另一实施例中，本专利技术提供一种将外源性DNA靶向插入到植物中的方法，其包 含以下步骤：（i)用以下转化经分离的植物细胞：(A)包含启动子较少的盒的第一双运载 体，所述载体包含（a)连接到（b)Ubi7内含子5'-未转译区的部分序列的右边界序列；(c) 融合到突变乙酰乳酸合成酶（ALS)基因的Ubi7单体编码序列；（d)所要核苷酸序列；以及 (e)终止序列，其中所要核苷酸序列未可操作地连接于启动子；以及（B)第二双运载体，其 包含（a)右边界；(b)正向表达盒和反向表达盒，其各自包含经修饰TAL效应子可操作地连 接于强组成性启动子和终止序列；以及（c)编码参与细胞分裂素制造的酶（例如异戊烯基 转移酶（ipt))的序列，其中经修饰TAL效应子经设计以结合马铃薯的泛素-7(Ubi7)基因 的内含子内的所要核苷酸序列；以及（ii)在促进表达所要核苷酸序列的植物生长的条件 下培养经分离的植物细胞；其中载体骨架DNA未永久地插入到植物基因组中。 在本专利技术的一个优选方面，经修饰TAL效应子包含（a)包含Fokl核酸内切酶催 化域的截短C端活化域；(b)密码子优化的目标序列结合域，其包含16. 5个对应于Ubi7 5'-未转译内含子序列的重复可变双残基；以及（c)包含SV40核定位序列的N端区。 在本专利技术的一个额外优选方面，所要核苷酸序列为靶向一或多种基因的沉默盒， 所述基因选自由天冬酰胺合成酶1 (Asnl)、多酚氧化酶（Ppo)和液泡转化酶（Inv)基因组成 的群组。在本专利技术的一个甚至更优选方面，第一双运载体另外包含晚疫病抗性基因Vntl，所 述基因可操作地连接于其原生启动子和终止序列。 在一不同实施例中，本专利技术提供一种经转化植物，其基因组中包含可操作地连接 于所要外源性核苷酸序列的内源性Ubi7启动子，所述外源性核苷酸序列可操作地连接于 外源性终止序列。在本专利技术的一个方面，一或多种选自由天冬酰胺合成酶1 (Asnl)、多酚氧 化酶（Ppo)和液泡转化酶（Inv)基因组成的群组的基因的表达下调。在本专利技术的一个优选 方面，植物另外表达晚疫病抗性基因Vntl。 在一个实施例中，经转化植物为具有块茎的植物。在一优选实施例中，具有块茎的 植物为马铃薯植物。优选地，经转化植物具有由以下中的一或多者表征的表型：晚疫病抗 性、黑斑碰伤耐受性、低温诱发的甜化降低和其块茎中的天冬酰胺含量降低。 在另一实施例中，本专利技术提供一种本专利技术的经转化植物的热加工产品。优选地，热 加工产品为法式炸薯条、薯片、脆片、马铃薯、脱水马铃薯或烤马铃薯。在本专利技术的一个优选 方面，热加工产品的丙烯酰胺含量低于相同物种的非转化植物的热加工产品。 在一不同实施例中，本专利技术提供一种经设计以结合到所要序列的经修饰TAL效应 子，所述所要序列包含（a)包含催化域的截短C端活化域；(b)密码子优化的目标序列结合 域；以及（c)包含核定位序列的N端区。在本专利技术的一个优选方面，经修饰TAL效应子经设 计以结合马铃薯的泛素_7(Ubi7)基因的内含子内的所要序列。因此，经修饰TAL效应子包 含（a)包含Fokl核酸内切酶的C端活化域中的催化域；(b)目标序列结合域，其包含16. 5 个对应于Ubi7 5'-未转译内含子序列的重复变数双残基；以及（c) N端区中的SV40核定位 序列。 在另一实施例中，本专利技术提供一种双运载体，其包含（a)右边界；(b)正向表达盒 和反向表达盒，其各自包含根据权利要求16所述的经修饰TAL效应子可操作地连接于强 组成性启动子和终止序列；以及（c)编码参与细胞分裂素制造的酶（例如异戊烯基转移酶 (ipt))的序列。 在另一实施例中，本专利技术提供一种包含启动子较少的盒的DNA构筑体，其包含（a) 连接到（b)部分Ubi7 5'-未转译内含子序列的右边界序列；（c)融合到突变乙酰乳酸合成 酶（ALS)基因的Ubi7单体编码序列；（d)所要核苷酸序列；（e)终止序列；以及（f)左边界， 其中所要核苷酸序列未可操作地连接于启动子。在本专利技术的一个优选方面，DNA构筑体中的 所要核苷酸序列为靶向一或多种基因的沉默盒，所述基因选自由天冬酰胺合成酶1 (Asnl)、 多酚氧化酶（Ppo)和液泡转化酶（Inv)基因组成的群组。在一个甚至更优选方面，DNA构 筑体另外包含晚疫病抗性基因Vntl，所述基因可操作地连接于其原生启动子和终止序列。 在一个不同实施例中，本专利技术提供一种将外源性DNA靶向插入到植物中的试剂 盒，其包含：(A)包含启动子较少的盒的第一双运载体，所述载体包含（a)连接到（b)Ubi7 内含子5'-未转译区的部分序列的右边界序列；（c)融合到突变乙酰乳酸合成酶（ALS)基 因的Ubi7单体编码序列；（d)所要核苷酸序列；以及（e)终止序列，其中所要核苷酸序列 未可操作地连接于启动子；以及（B)第二双运载体，其包含（a)右边界；(b)正向表达盒和 反向表达盒，其各自包含经修饰TAL效应子可操作地连接于强组成性启动子和终止序列； 以及（c)编码异戊烯基转移酶（ipt)的序列。在本专利技术的一个优选方面，经修饰TAL效应 子经设计以结合马铃薯的泛素-7 (Ubi7)基因的内含子内的所要核苷酸序列，并且包含（a) 包含Fokl核酸内切酶催化域的截短C端活化域；(b)密码子优化的目标序列结合域，其包 含16. 5个对应于Ubi7 5'-未转译内含子序列的重复可变双残基；以及（c)包含SV40核定 位序列的N端区。在本专利技术的另一个优选方面，所要核苷酸序列为靶向一或多种基因的沉 默盒，所述基因选自本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将所要多核苷酸稳定整合到植物基因组中的方法，其包含(A)用包含编码TAL蛋白质的核苷酸序列的第一载体转化植物材料，所述核苷酸序列经设计以识别目标序列；(B)用第二载体转化所述植物材料，所述第二载体包含(i)标记基因，其未可操作地连接于启动子(“无启动子的标记盒”)且其包含与所述目标序列同源的序列；以及(ii)所要多核苷酸；以及(C)鉴别所述所要多核苷酸经稳定整合的经转化植物材料。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·M·罗门思，段辉，T·J·威克斯，
申请(专利权)人：杰尔辛普洛公司，
类型：发明
国别省市：美国;US