本发明专利技术提供一种脓毒症的诊断、危重程度监测和预后评估的方法，即外周血白细胞中线粒体呼吸链超复合物：NADH-细胞色素C氧化还原酶（NADH: cytosome C oxidoreductase，NCR）的酶活性水平，线粒体NCR酶活性水平与脓毒症的器官功能障碍和预后存在密切相关。本发明专利技术还提供了一种检测外周血白细胞线粒体呼吸链超复合物NCR酶活性的检测方法和检测试剂。本发明专利技术提供的外周血线粒体NCR活性检测的方法可以快速、特异和灵敏的测定样本中线粒体NCR酶活性，对于脓毒症的诊断、危重程度监测和预后评估具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于感染炎症类疾病的危重程度判定和预后评估
，即脓毒症（Sepsis）的多器官功能障碍的判定和预后评估。具体而言本专利技术提供了一种从线粒体亚细胞水平对脓毒症的诊断、危重程度监测和预后评估的检测方法，该检测方法主要是测定线粒体呼吸链超复合物NADH-细胞色素C氧化还原酶（NADH: cytosome C oxidoreductase，NCR ）的酶活性，同时本专利技术还提供了作为线粒体NCR的酶活性分析和检测的方法和试剂。
技术介绍
脓毒症（Sepsis）是指由感染引起的全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome, SIRS），是由于微生物（如细菌、真菌、病毒、寄生虫等）侵入人体而诱发的激烈全身炎症反应，并对组织具有损伤性的病理生理过程的一组临床表现，常常继发于严重疾病，如严重烧伤、多发伤、外科手术后等。严重脓毒症可以导致脓毒性休克、多器官功能障碍（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），是重症监护病房内非心脏病死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒症的病死率仍高达30%～70%，全球每天约14,000人死于其并发症，对人类健康和经济发展构成极大的威胁和挑战。临床实践表明, 脓毒症的许多特异性治疗手段如抗炎治疗、促炎治疗、皮质激素的使用等都是非常危险的“双刃剑”， 这些治疗的选择必须在对病人进行正确分级、分期的基础上进行。仅仅根据临床表现和非特异性的实验室数据，盲目使用很可能导致病情恶化和脏器功能衰竭，以及对医疗资源的浪费。随着现代生物技术的发展，人们发现很多生物标志物可用于脓毒症的早期诊断、病情及预后判断、疗效评估，并以此判断疾病的病理生理状态，从而指导治疗。有效的生物学标志物检测成为了脓毒症诊断治疗的重要手段，其中比较有价值的生物标志物有C 反应蛋白、降钙素原、sTREM-1、NT-proBNP以及部分细胞因子和白细胞分化抗原等。C 反应蛋白( C-reactive protein，CRP)系急性时相蛋白，不仅能够与细菌、真菌等微生物的多聚糖结合，而且可激活补体系统，促进噬菌作用。CRP 由肝实质细胞产生，正常人群水平在10 mg /L以下，感染发生后4～6 h 即开始升高，36～50 h 达高峰，峰值可达正常参考值的数百倍，感染消除后其水平急骤下降，1 周内可恢复至正常，而在病毒感染时无显著升高，这为早期感染类型的鉴别提供了极其重要的依据。因此，作为相关的非特异性炎性标志物被广泛应用。但CRP 对脓毒症的诊断价值差异较大，其作为成人脓毒症生物标志物具有较低的特异性，通常用于新生儿早期脓毒症的筛查。此外，其他炎症性疾病( 如烧伤、创伤、大手术、恶性肿瘤等)也可导致CRP 明显升高。降钙素原( Procalcitonin，PCT) 是降钙素激素的前体，被视为细菌感染的可靠生物标志物之一。研究显示，正常人血清PCT浓度低于0.1ug/L，非特异性感染、病毒性炎症及局部感染等疾病时不增加或轻微增加，感染后2 h即可在血浆中迅速检测到，严重感染时可升高2000 倍以上，PCT半衰期为22~26h，与CRP等急性时相蛋白相比更具优势。研究证明PCT 的最佳阈值为0.47μg/L时，其对脓毒症的诊断灵敏度和特异度分别为83%和81%。但也有研究者质疑PCT 对脓毒症的诊断和预后的准确性，认为PCT 并不与感染严重程度相一致。一项就PCT 对脓毒症诊断价值荟萃分析发现，其平均灵敏度和特异度只有71%，受试者工作特征曲线下面积也只有0.78。虽然如此，目前，PCT水平已被用于指导急性慢性支气管炎加重，社区获得性肺炎(CAP)及脓毒症的实验性抗菌治疗。并且，PCT水平还可以和常规的临床参数一起辅助判断患者的实验性抗菌治疗是否有效。通过连续监测PCT水平来判断是否可以结束抗菌素治疗是其最有价值的应用。髓系细胞表达触发受体-1（TREM-1）属于免疫球蛋白超家族，选择性地表达于中性粒细胞和部分单核细胞，在多种炎症反应中表达上调。机体在细菌或真菌感染时中性粒细胞和单核-巨噬细胞表面表达TREM-1 显著增加，脱落入血即sTREM-1(可溶性髓系细胞表达触发受体1)。研究证明，在区分脓毒症和非感染性炎症时， sTREM-1是一个非常有意义的早期参数。虽然如此，一项对11个研究（包括1795例患者）的荟萃分析发现，sTREM-1对脓毒症的诊断的整体灵敏度和特异性分别为79%（95%置信区间，65~89）和80%（95%置信区间，69~88），ROC曲线下面积为0.87（95%置信区间，0.84~0.89）。最终得出，血浆sTREM-1在区分脓毒症及SIRS中表现中等，不足以用于系统性炎症患者的脓毒症诊断。尿钠肽(BNP)为活化的神经内分泌激素，由心室肌细胞产生，心肌壁及心室壁压力的增加为主要刺激源，促进BNP的释放。BNP的生理学效应包括利尿、拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统及刺激鸟苷酸环化酶引起血管扩张。NT-proBNP为BNP前体氨基末端，心室容积扩大及心力衰竭时，血浆BNP和NT-proBNP水平升高，是一种有效的心室前负荷和心功能预测标志物。脓毒症早期常出现血流动力学改变和心脏功能障碍。据报道，脓毒症、脓毒性休克及急性心衰与BNP和NT-proBNP水平升高有关。且因NT-proBNP在血液循环中比尿钠肽有更长的半衰期，这使得它具有更好的敏感性和特异性。统计分析57例脓毒症患者的数据后发现，血浆B 型尿钠肽前体N 末端水平在严重脓毒症时可作为一个早期心功能障碍和心肌抑制有用的生物指标，如果阈值定在3360 ng /L，其灵敏度为75%，特异性为90.2%。细胞因子中有代表性的包括白细胞介素家族（IL-1、2、4、6、8、10及12）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素、巨噬细胞炎症蛋白（MIP）、干扰素诱导蛋白10（IP-10）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）等。这些因子在脓毒症早期有一定的诊断价值，其中研究较多的IL-6一般认为对脓毒症有重要的预测价值，且IL-6有缓慢而稳定的动力学特征，容易在血液中被检测，成为脓毒症的重要细胞因子生物标志物。研究表明，脓毒症患者血IL-6 水平明显增高，且脓毒症的严重程度及预后与其增高幅度相关，IL-6水平持续增高者多器官功能障碍综合征的发生率和病死率明显增加，如以25 ng /L为阈值时，对脓毒症有较高的诊断价值，其灵敏度为81.1%，特异度为78.9%。但也有研究显示，IL-6水平在全身炎性反应综合征和脓毒症之间的差别不大，诊断脓毒症的灵敏度( 67%) 和特异度( 65%)不高。白细胞分化抗原是白细胞表面标志物，其异常表达通常意味着白细胞数目和功能的变化，故可能作为脓毒症的标志物，迄今报道的表面抗原包括CD10、11、14、18、25、28、40、48、64、69、80及163等。其中CD64研究较多，它选择性表达于单核/巨噬细胞，正常人成熟中性粒细胞不表达。研究发现脓毒症患者中性粒细胞表面CD64表达增加，可刺激并诱导炎本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从线粒体水平诊断脓毒症、监测危重程度和评估预后的方法，其组成为：脓毒症患者外周血白血细胞中线粒体呼吸链超复合物NADH‑细胞色素C氧化还原酶（NADH: cytosome C oxidoreductase，NCR）的酶活性水平；线粒体NCR酶活性下降用于脓毒症的诊断、危重程度的监测和不良预后的评估。
【技术特征摘要】
1.一种从线粒体水平诊断脓毒症、监测危重程度和评估预后的方法，其组成为：脓毒症患者外周血白血细胞中线粒体呼吸链超复合物NADH-细胞色素C氧化还原酶（NADH: cytosome C oxidoreductase，NCR）的酶活性水平；线粒体NCR酶活性下降用于脓毒症的诊断、危重程度的监测和不良预后的评估。
2.如权利要求书1所述的方法，其中线粒体NCR功能水平是通过检测其酶活力来确定的，该酶活性检测的原理为：NCR在特定条件下催化将NADH中的电子转移给电子受体辅酶Q，生成还原型辅酶Q进一步将电子转移给氧化型细胞色素C生成还原型细胞色素C；还原型细胞色素C在特定波长下具有特异的光吸收，在特定条件下可检测到还原型细胞色素C的光吸收值，由于NCR催化底物的反应速率与还原型细胞色素C的生产量成正比，因此，检测还原型细胞色素C的吸光值，就可以计算出NCR的酶活性水平。
3.一种NCR酶活性检测试剂，其特征在于：它是根据权利要求书2所述的原理和方法来开发配制的，它主要用于NCR活性分析和检测。
4.如权利要求书3所述的NCR酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分包括如权利要求书2所述的电子受体氧化型细胞色素C和电子供体NADH，这种检测试剂主要用于NCR的酶活性的分析和检测。
5.如权利要求书3-4所述的NCR酶活性检测试剂，其特征在于：其成分中还可以包括抑制剂，这种抑制剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制NCR酶活力的试剂或分子。
6.如权利要求书3-4所述的NCR酶活性检测试剂，其特征在于其成分还可以包括缓冲液和稳定剂，所述的稳定剂是被物理、化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂；所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.0-9.0的范围中的试剂。
7.一种NCR酶活性检测试剂，其特征在于：它是基于权利要求书1-6所述的原理、方法和试剂的基础上开发配制的，其主要成分包括：
如权利要求书6所述的缓冲液 10-1000mmol/L
pH范围 ...
【专利技术属性】
技术研发人员：张琪，朱伟文，李宁，郝淑静，胡洁，郭琳瑛，李伟，卢秀秀，王志龙，
申请(专利权)人：首都儿科研究所附属儿童医院，北京中科非凡生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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