本发明专利技术公开了一种利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法。本方法所用细菌为木醋杆菌(Acetobacter xylinum RZS.1)，具体步骤如下：首先采用静电纺丝技术制备海藻酸钙小球，灭菌。在发酵形成一定厚度的细菌纤维素膜后，将海藻酸钙小球均匀铺撒在膜上，继续静态培养。待培养结束后，除去细菌及残留的发酵液，再除去掺杂其中的海藻酸钙小球，最后用去离子水冲洗数遍即可。使用本方法制备的细菌纤维素孔径得到调控，且海藻酸钙小球的尺寸大小可控，使得细菌纤维素的孔径尺寸在一定范围内可以任意改变。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物材料制备领域。
技术介绍
细菌纤维素(Bacterial cellulose，简称BC)是由多种微生物分泌合成的一种胞外多糖，静置条件下培养，会在培养液-空气表面形成一种水凝胶膜。BC与植物纤维素(Plant cellulose，简称PC)具有相同的化学组成成分，但相比于PC，BC具有一些优越的性能，如拉伸强度高，纯度高，生物相容性好，且具有三维纳米网络结构。基于BC的优良性能，BC已作为再生组织用于人造皮肤、血管移植等。但BC的纤维网络尺寸过小，使哺乳动物细胞在培养过程中不能渗透生长进入BC内部，限制了 BC在组织工程材料上的应用。目前已发展多种提高细胞孔隙率，改变细胞空洞结构的方法，多种文献均有报道(1Baah-Dwomoh A, Rolong A, Gatenholm P, et al.The feasibility ofusing irreversible electroporat1n to introduce pores in bacterial cellulosescaffolds for tissue engineering.Appl Microbial B1technol, 2015:1-10.2Yin N,Stilwell M D, Santos T M A, et al.Agarose particle—templated porous bacterialcellulose and its applicat1n in cartilage growth in vitr0.Acta b1materialia,2015, 12:129-138.3 Andersson J, Stenhamre H, Backdahl H, Gatenholm P.Behav1rof human chondrocytes in engineered porous bacterial cellulose scaffolds.Journal of B1medical Materials Research Part A, 2010, 94A: 1124 - 1132.)，如发酵过程中掺入石蜡小球、淀粉颗粒及琼脂小球等，但这些方法都存在一定的缺陷，如石蜡不易除去，反复处理会对已形成的孔洞结构造成破坏，淀粉颗粒会发生沉淀，制孔效果不明显，琼脂小球不易灭菌，BC培养过程存在染菌风险。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种有效调节细菌纤维素三维结构的方法。本专利技术的原理是:木醋杆菌(Jce1Aacier xylinum RZS.1，简称A xy RZS.1)是一种严格好氧菌，是BC生产的模式菌株。本专利技术中使用A.xr RZS.1，通过静态培养，获得正在生长的BC膜，向BC膜上铺撒海藻酸钙小球，利用A.^ RZS.1的好氧性及对营养的趋向性，细胞会穿过海藻酸钙小球向空气界面渗透移动，在随后合成BC的过程中，会将海藻酸钙小球包裹进纤维素网络结构中。由于通过静电纺丝条件的改变，调节海藻酸钙小球的大小，且获得的小球尺寸均一，这样可以制备不同孔径结构的BC。海藻酸钙小球是由钙离子交联的多糖，易于去除，在后处理的过程中不会对已调节形成的三维结构造成明显的影响。实现本专利技术目的的技术解决方案为:，包括如下步骤:第一步:分别配制5-30 g/L的海藻酸钠溶液和10-100 g/L氯化钙溶液(氯化钙用作交联剂)，控制流速5-20 ml/h、电压4-20 kV，采用静电纺丝技术制备海藻酸钙小球，将小球固定化2-36 h后，115_121°C灭菌15-30 min，冷却至室温，备用； 第二步:木醋杆菌进行种子扩增培养； 第三步:制备发酵液； 第四步:接种后，在25-32°C条件下进行静态培养，静态培养1-5天后，在已形成的细菌纤维素凝胶表面均匀铺撒上海藻酸钙小球，继续静态培养； 第五步:静态培养结束后，取出上层膜，用0.1-lmol/L EDTA溶液溶解海藻酸钙小球； 第六步:去除残留的细胞及发酵液，用去离子水冲洗BC膜至中性。第二步中，种子液配方为:葡萄糖20 g/L、硫酸铵6 g/L、磷酸二氢钾I g/L、硫酸镁0.4 g/L、蛋白胨3 g/L、酵母浸粉2.25 g/L和羧甲基纤维素钠0.4 g/L。第三步中，发酵液配方为:葡萄糖22.5 g/L、蔗糖27.5 g/L、硫酸铵I g/L、磷酸二氢钾5 g/L、硫酸镁0.7 g/L、乳酸钙0.2 g/L、柠檬酸0.6 8/1、醋酸1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉7.5 g/L和羧甲基纤维素钠0.4 g/L。本专利技术与现有技术相比其显著优点是: 1、海藻酸钠为天然多糖，且具有药物制剂敷料所需的安全性，对细菌生长代谢亦无影响。2、采用静电纺丝技术制备海藻酸钙小球，可以通过控制电压和流速，获得不同尺寸的海藻酸钙小球。3、海藻酸钙小球易于去除，用EDTA溶液溶解即可。下面结合附图对本专利技术作进一步详细描述。【附图说明】图1是利用海藻酸钙调节BC结构的流程图。图2是实施例1制备的海藻酸钙小球的显微镜放大图。图3是本专利技术实施例1的结构经调控的BC扫描电镜图。图4是本专利技术对比例的结构未经调控的BC扫描电镜图。【具体实施方式】结合附图1，调节细菌纤维素结构的方法，步骤如下: 第一步:配制5-30 g/L的海藻酸钠、10-100 g/L氯化钙溶液，静电纺丝控制流速5-20mL/h、电压4-20 kV，制备海藻酸钙小球，固定化一段时间后，高温灭菌，冷却至室温，备用；第二步:木醋杆菌在温度25-32°C，摇床转速90-250 rpm条件下进行种子扩增培养，培养 6-72 h ； 第三步:发酵液配制，高压蒸汽灭菌，冷却至室温，以2-20%接种量接种，进行静态培养; 第四步:静态培养1-3天后，在已形成的细菌纤维素凝胶表面均匀铺撒上1-5 mm厚的海藻酸钙小球，继续静态培养； 第五步:发酵结束后，取出上层膜，用浓度0.1-lmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，搅拌至海藻酸钙小球溶解； 第六步:将第五步获得的膜浸泡在含质量分数1-10 g/L的NaOH、1-10 g/L的H2O2溶液中，在70-100°C条件下水浴0.5-3.0小时，去除残留的细胞及发酵液； 第七步:用流动的去离子水冲洗BC膜至中性。在所有实施案例中， 种子液配方采用:葡萄糖22.5 8/1，蔗糖27.5 g/L，硫酸铵I g/L，磷酸二氢钾5 g/L,硫酸镁0.7 g/L，乳酸钙0.2 g/L,柠檬酸0.6 8/1，醋酸1.5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉7.5 g/L，羧甲基纤维素钠0.4 g/L ο发酵液配方采用:葡萄糖22.5 g/L，蔗糖27.5 g/L，硫酸铵I 当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步：分别配制5‑30 g/L的海藻酸钠溶液和10‑100 g/L氯化钙溶液，控制流速5‑20 ml/h、电压4‑20 kV，采用静电纺丝技术制备海藻酸钙小球，将小球固定化2‑36 h后，115‑121℃灭菌15‑30 min，冷却至室温，备用；第二步：木醋杆菌进行种子扩增培养；第三步：制备发酵液；第四步：接种后，在25‑32℃条件下进行静态培养，静态培养后，在已形成的细菌纤维素凝胶表面均匀铺撒上海藻酸钙小球，继续静态培养；第五步：静态培养结束后，取出上层膜，用0.1‑1mol/L EDTA溶液溶解海藻酸钙小球；第六步：去除残留的细胞及发酵液，用去离子水冲洗BC膜至中性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张衡，朱春林，杨加志，陈春涛，黄洋，
申请(专利权)人：南京荣之盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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