一种可扩展检测范围的捕获抗体竞争夹心免疫检测方法及生物传感器技术

本发明专利技术公开了一种可扩展检测范围的捕获抗体竞争夹心免疫检测方法及生物传感器。本发明专利技术利用捕获抗体竞争夹心免疫法检测待检测抗原的浓度，即待测样本中的抗原先与游离捕获抗体和标记抗体反应，再与固定捕获抗体反应，形成的免疫复合物中只有标记抗体-抗原-固定捕获抗体这一种复合物可以被检测到，通过测量该免疫复合物标记抗体上的标记信号来确定抗原的浓度。由于游离捕获抗体-抗原-标记抗体复合物和游离捕获抗体-抗原复合物不能够被检测仪器所检测，达到了间接稀释待测样本中抗原浓度的目的，扩展了待测样本抗原浓度的检测范围。同时利用该方法制备的生物传感器测试卡具有检测范围宽、灵敏度高和检测时间短的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫检测
，更具体地，涉及一种可扩展检测范围的捕获抗体竞争夹心免疫检测方法及生物传感器。
技术介绍
免疫检测是利用免疫学原理检测样本中待测物质，其方法可分为定性方法和定量方法。免疫检测具有特异、简便、快速、准确、灵敏的优点，根据检测原理的不同，免疫检测可以分为间接法、夹心法(包括双抗原夹心法和双抗体夹心法)、捕获法、竞争法等，每种方法有各自的优点和局限性。传统的双抗体夹心免疫反应(sandwich immunoassay)的原理是以抗原为检测靶标。将固相载体的表面进行化学处理，使固相载体表面覆盖能结合抗体的材料，将捕获抗体固定于固相载体上，形成固定捕获抗体，然后将抗原和标记抗体与固定捕获抗体相接触，进而形成固定捕获抗体-抗原-标记抗体三明治复合物，通过对标记抗体上标记物的检测，实现对抗原的定量检测。这种技术已经广泛应用于临床、环境、食品、海关等的检测中，然而该技术的缺点是检测范围窄，通常仅能满足检测样本检测下限灵敏度，但是无法满足检测上限的要求，在检测上限存在HD-Hook区，无法给出准确的数值。因此，对于高浓度样本必须通过高倍稀释才能检测，从而增加的检测的步骤，引入较大的操作误差，延长的检测所用的时间。例如超敏C-反应蛋白，临床上对其检测灵敏度的要求一般在几到几十ng/ml，而对于检测上限的要求是10μg/mL，而超敏C-反应蛋白的正常范围是小于1μg/mL，病理范围是1-10μg/mL，因而如果传统的一步双抗体夹心免疫检测方法给出的检测结果在HD-Hook区，需要对样本进行稀释，然后再进行检测，而因待测样本的信号强度位于HD-Hook区时，因不能确定待测样本的大概浓度，所以不能指示样本的稀释倍数。因而传统的双抗体夹心免疫检测方法会有检测步骤繁琐、检测时间长的问题。目前传统的双抗体夹心ELISA法，是将捕获抗体固定于固相表面，并将待测样本与捕获抗体相接触，形成捕获抗体-抗原的二元复合物，进而将酶标记的抗体与该二元复合物相接触，形成捕获抗体-抗原-酶标记抗体的三元复合物，通过三元复合物中的酶与底物反应显色来确定待测样本中抗 原的浓度，检测范围一般在1-1000ng/ml范围，尽管酶联免疫法对检测上限具有明显的扩展，但是对于有些抗原仍然不能满足检测的需要，同时由于其需要通过底物显色，因而增加了步骤较多，增长了检测时间，因此利用传统的双抗体夹心免疫法和酶联免疫法进行临床检测时，存在检测上限低，需要对样本进行高倍稀释，不能满足高浓度样本快速直接检测要求的问题。免疫竞争法原理是标本中的抗原和一定量的标记抗原竞争与固定捕获抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固定捕获抗体上的标记抗原愈少，最后的检测信号越弱。结合于固定捕获抗体上的标记抗原量与样本中被检抗原浓度呈负相关，此方法检测上限高，但是无法实现检测下限的灵敏度，不能简化操作步骤。因此需要提供一种灵敏度高，检测范围宽、操作简便、检测时间短、对检测设备要求低的检测方法。。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种检测范围宽，检测时间短，容易操作且步骤少的方法。为了实现上述专利技术目的本专利技术提供了下述技术方案：捕获抗体竞争双抗体夹心免疫法，包括游离捕获抗体、标记抗体和固定捕获抗体。其中游离捕获抗体，无标记，与标记抗体在抗原上结合的表位不同。固定捕获抗体固定于固相载体上。首先用游离捕获抗体与固定捕获抗体竞争结合待测抗原，形成的抗原抗体复合物与标记抗体结合，反应过程中会形成四种复合物，即标记抗体-抗原的复合物、游离捕获抗体-抗原的复合物、标记抗体-抗原-固定捕获抗体夹心复合物、游离捕获抗体-抗原-标记抗体复合物，其中只有标记抗体与抗原-固定捕获抗体形成的夹心复合物能通过标记做进一步检测，由于标记抗体-抗原的复合物、游离捕获抗体-抗原的复合物和游离捕获抗体-抗原-标记抗体的复合物不能被检测，相当于减少了与待测液中捕获抗体反应的抗原量，从而拓展了检测范围。本专利技术所述的抗原是指具有免疫原性的物质，如蛋白质和多肽，代表性的抗原包括(但不限于)：细胞因子、肿瘤标志物、金属蛋白、非肿瘤疾病标志物或微生物表达的蛋白等。本专利技术方法包括如下步骤：1)将标记抗体与游离捕获抗体混合，形成二者的混合液；2)将待测样本和所述混合液混合，形成三者的混合物；3)所述三者的混合物与固定捕获抗体反应；4)去除反应液； 5)检测所述固定捕获抗体-抗原-标记抗体复合物中的标记抗体上的标记信号并计算抗原的浓度。所述固定捕获抗体固定于固相载体上；所述固相载体的材料为单晶硅、合成玻璃、聚苯乙烯、金膜、硝化纤维、氟化聚乙烯、聚阳离子树脂、亲水性聚合物薄膜或多孔化材料，优选地，所述固相载体的材料为单晶硅、树脂、玻璃、硝化纤维树脂、氟化聚乙烯或聚苯乙烯。用于固定捕获抗体固定的材料表面需要化学处理，处理方法为硅化、氨基化、醛基化、巯基化、环氧化以及活性酯化，优选环氧化或氨基化。优选地，固定捕获抗体固定后，用含1％BSA的PBST溶液、5％的脱脂奶粉或1％的鱼皮胶封闭，更优选地用含1％的BSA的PBST溶液封闭；优选地，捕获抗体与标记抗体结合于目标抗原的不同表位；所述游离捕获抗体和固定捕获抗体不能与待测抗原形成游离捕获抗体-抗原-固定捕获抗体复合物；游离捕获抗体和固定捕获抗体可以为不同的分子，也可以为相同的分子，优选地，二者为相同的分子；优选地，游离捕获抗体与固相捕获抗体的摩尔比为1:1-1:4；优选地，标记抗体与固定捕获抗体的摩尔比为3:1-1:1；优选地，反应液孵育时间5-7分钟；优选地，标记抗体的标记物为磁珠、化学发光、荧光、胶体金、胶体银，更优选地磁珠、化学发光或胶体金；优选地，游离捕获抗体和标记抗体预先混合在一起，形成储备液。本专利技术还研制了可扩展检测范围的一步竞争夹心免疫检测生物传感器，其技术方案如下：一种可扩展检测范围的捕获抗体竞争夹心免疫检测生物传感器，其特征在于包括传感器测试卡，所述传感器测试卡包括盖板、支撑板和底板，支撑板位于盖板和底板之间，支撑板上设置有至少一条微通道，所述微通道包括试剂存储区、免疫反应区和废液区；所述免疫反应区包含固定捕获抗体，所述试剂储存区的位置所对应的盖板上设有注液孔，废液区的位置所对应的盖板上设有排液孔。其中所述试剂储存区包含游离捕获抗体和标记抗体。一种可扩展检测范围的捕获抗体竞争夹心免疫检测生物传感器，包括传感器测试卡，所述传感器测试卡包括盖板和底板，盖板和底板之间形成微通 道，所述微通道包括免疫反应区，所述免疫反应区包含固定捕获抗体，所述盖板每端有一个有注/排液孔和排/注液孔。优选地，底板尺寸为长度为40-100mm，宽度为25-40mm，厚度为1-5mm；优选地，盖板的尺寸与底板相同；优选地，微孔通道的深度为0.1-0.5mm，长度为6-9cm；优选地，微孔通道设置有试剂存储区和废液区；优选地，免疫反应区用于固定捕获抗体的固定，其材料为单晶硅、玻璃、聚苯乙烯、金膜、硝化纤维、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可扩展检测范围的捕获抗体竞争夹心免疫检测生物传感器，包括传感器测试卡，其特征在于：传感器测试卡包括盖板、支撑板和底板，支撑板位于盖板和底板之间；所述支撑板上设有至少一条微通道，所述微通道包括试剂存储区、免疫反应区和废液区，所述免疫反应区表面设有固定捕获抗体，所述试剂储存区存储游离捕获抗体和标记抗体；所述试剂储存区的位置所对应的盖板上设有注液孔，所述废液区的位置所对应的盖板上设有排液孔。

【技术特征摘要】
1.一种可扩展检测范围的捕获抗体竞争夹心免疫检测生物传感器，包括
传感器测试卡，其特征在于：传感器测试卡包括盖板、支撑板和底板，支撑
板位于盖板和底板之间；所述支撑板上设有至少一条微通道，所述微通道包
括试剂存储区、免疫反应区和废液区，所述免疫反应区表面设有固定捕获抗
体，所述试剂储存区存储游离捕获抗体和标记抗体；所述试剂储存区的位置
所对应的盖板上设有注液孔，所述废液区的位置所对应的盖板上设有排液孔。
2.一种可扩展检测范围的捕获抗体竞争夹心免疫检测生物传感器，包括
传感器测试卡，其特征在于：传感器测试卡包括盖板和底板；盖板和底板之
间形成微通道，所述微通道包括免疫反应区，所述免疫反应区表面设有固定
捕获抗体，所述盖板上设有注液孔和排液孔。
3.根据权利要求1或2所述的一种可扩展检测范围的捕获抗体竞争夹心
免疫检测生物传感器，其特征在于：所述传感器测试卡的微通道的免疫反应
区的材料为单晶硅、玻璃、聚苯乙烯、金膜、硝化纤维、氟化聚乙烯、聚阳
离子树脂、亲水性聚合物薄膜、多孔材料、树脂、硝化纤维树脂。
4.根据权利要求1或2所述的一种可扩展检测范围的捕获抗体竞争夹心
免疫检测生物传感器，其特征在于：所述传感器测试卡微孔通道的深度为
0.1-0.5mm，长度为6-9cm。

【专利技术属性】
技术研发人员：高云华，高宇哲，
申请(专利权)人：中国科学院理化技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11