葛根中提取抑制破骨细胞形成有效部位的方法技术

本发明专利技术提供了一种抑制破骨细胞形成的葛根有效部位及其提取方法。本发明专利技术葛根有效部位的提取方法为：取干燥葛根中加入2-5倍量的蒸馏水提取2次，合并滤液；滤液旋转蒸发水分，得滤饼；滤饼中加入2-10倍量的60-70%乙醇，搅拌溶解提取2-3次，过滤，合并滤液，回收乙醇，得乙醇浸膏；乙醇浸膏中，加入1倍体积的蒸馏水热溶，用乙酸乙酯萃取2-3次，合并滤液，回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏；乙酸乙酯浸膏冷冻干燥，得粉末状葛根有效部位。本发明专利技术的葛根有效部位提取方法简单，得到的葛根有效部位具有显著的破骨细胞形成抑制作用。本发明专利技术的葛根有效部位来源于天然药物，副作用少，使用安全。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及葛根提取物，尤其是涉及抑制破骨细胞形成的葛根提取物及其制备 方法。
技术介绍
葛根为豆科植物，其味甘凉可口，具有清热、降火、排毒诸功效。葛根中含有葛根 素、葛雌素、葛根素木糖甙、大豆黄酮等多种异黄酮类物质。近代药理研究表明，葛根具有多 种生物活性，如葛根水煎剂、醇浸膏、总黄酮和葛根素均有明显的扩张冠状血管的作用，葛 根总黄酮和葛根素能减慢心率，降低心脏总外周阻力，减少心肌耗氧量。葛根配合其他中草 药用于骨质疏松症的治疗，但尚没有明确葛根中具有抗骨质疏松症的有效成分。 骨质疏松症是由于骨吸收增加而引起的骨代谢性疾病。破骨细胞是唯一具有骨吸 收功能的细胞，破骨细胞的形成或其功能的改变所导致的骨改建失衡是骨质疏松的重要病 理基础。因此，抑制破骨细胞的形成或抑制骨吸收功能的药物是防治骨质疏松症的有效途 径。 目前已有多种抑制破骨细胞形成药物，但由于其价格高，长期服用引起多种副作 用等缺点，在其广泛使用上有较多的局限性，需要开发安全，价廉的新药。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来源于天然药物的，具有抑制破骨细胞形成的植物提 取有效部位。 本专利技术通过大量的文献调查和筛选试验，从天然药物原料葛根中提取分离得到抑 制破骨细胞形成的葛根有效部位。 具有抑制破骨细胞形成的葛根有效部位的提取方法为如下： (1)取干燥葛根，切成厚度为l-3mm的小片； (2)加入2-5倍量的蒸馏水提取2次，合并滤液； (3)滤液旋转蒸发水分，得滤饼； (4)滤饼中加入2-10倍量的60-70%乙醇，搅拌溶解提取2-3次，过滤，合并滤液， 回收乙醇，得乙醇浸膏； (5)乙醇浸膏中，加入1倍体积的蒸馏水热溶，用乙酸乙酯萃取2-3次，合并滤液， 回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏； (6)乙酸乙酯浸膏冷冻干燥，得粉末状葛根有效部位。 在优选的技术方案中，所述的步骤（4)中，所述搅拌溶解提取温度为56°C。 再优选的技术方案中，所述的步骤（2)所述的蒸馏水提取温度为80°C。 又一优选的技术方案中，所述的步骤（5)中乙醇浸膏与乙酸乙酯的比例为1:2-4。 本专利技术的葛根提取物具有很好的抑制破骨细胞形成的作用，并来源于天然药物， 副作用少，使用安全。 本专利技术的葛根提取物，提取方法简单，易于工业化生产。【具体实施方式】 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以 任何方式限制本专利技术。实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和 材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或可以常规方法制备。 实施例1葛根中抑制破骨细胞形成的葛根有效部位的提取 (1)取干燥葛根，切成厚度为l-3mm的小片； (2)加入3倍量的蒸馏水在80°C提取2次，每次2小时，合并滤液； (3)滤液旋转蒸发水分，得滤饼； (4)滤饼中加入5倍量的60-70%乙醇，在56°C条件下，搅拌溶解提取3次，其中 第1次提取时间为3小时，第2-3次的提取时间为1. 5小时；合并滤液，回收乙醇，得乙醇浸 膏； (5)乙醇浸膏中，加入1倍体积的蒸馏水热溶，用乙酸乙酯萃取2次，乙醇浸膏和乙 酸乙酯的比例为1:3,合并滤液，回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏； (6)乙酸乙酯浸膏冷冻干燥，得粉末状葛根有效部位。 实施例2葛根有效部位对破骨细胞形成的影响 (1)破骨细胞的培养：取4周龄的SD雄性大鼠，麻醉后托颈处死，放在75%乙醇中 浸泡片刻，在无菌条件下，取出大鼠大腿骨和胫骨，去净骨表面的软组织，用无菌PBS反复 冲洗2-3次，最后置于含有15%胎牛血清的DMEM培养液中，剪断大腿骨和胫骨的两端，并用 注射器取吸取含15%胎牛血清的DMEM培养液，反复冲洗骨髓细胞，直至骨头发白。将冲洗 的骨髓细胞收集于50ml离心管中，在1000rpm，4°C下离心10分钟，去上清液。再加入DMEM 培养液，将离心管内的细胞均匀悬浮于培养液中，再离心，去上清液，反复洗2-3次。最后加 入适量含有15%胎牛血清的DMEM培养液吹打均匀，上葡聚糖凝胶S印hadex GlO色谱柱， 用含有15%胎牛血清的DMEM培养液，收集洗脱液中的细胞，1000rpm，4°C下离心10分钟， 去上清液。细胞中加入适量培养培养液，并加入含有la，25(0H) 2D3 (VD3)、破骨细胞生成因 子（RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)的15%胎牛血清的DMEM，其中VD 3、RANKL和 M-CSF的最终浓度分别为l(T8M、50ng/ml、20ng/ml。加入细胞因子的细胞种于24孔板中，每 孔中的细胞数IX IO6个细胞。 将实施例1制备的葛根有效部位溶于DMEM培养液中，配制成一定浓度，然后加入 到上述破骨细胞的培养体系中，葛根有效部位在培养体系中的最终浓度分别为30ug/ml、 10ug/ml、3ug/ml、lug/ml、0. lug/ml，各浓度设4个平行孔。未加入药物的组作为对照组。在 37°C，5%C02培养箱中培养，每2天换液，共培养4天。培养结束后，轻轻吸取培养上清液后 加入0. 5ml/孔0. 5%TRIT0NX-100,放置20分钟，固定细胞。清除固定液，细胞用PBS轻轻清 洗2-3次，用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP)染色试剂盒（sigma，N 〇387)染色，并在显微镜下 统计具有3个以上细胞核的TRAP阳性破骨细胞，结果如表1。 表1.葛根提取物对破骨细胞形成的影响【主权项】1. 一种，包括如下步骤： (1) 取干燥葛根，切成厚度为1-3_的小片； (2) 加入2-5倍量的蒸馏水提取2次，合并滤液； (3) 滤液旋转蒸发水分，得滤饼； (4) 滤饼中加入2-10倍量的60-70%乙醇，搅拌溶解提取2-3次，过滤，合并滤液，回收 乙醇，得乙醇浸膏； (5) 乙醇浸膏中，加入1倍体积的蒸馏水热溶，用乙酸乙酯萃取2-3次，合并滤液，回收 溶剂，得乙酸乙酯浸膏； (6) 乙酸乙酯浸膏冷冻干燥，得粉末状葛根有效部位。2. 根据权利要求1所述的，其特征在 于，步骤（4)中所述搅拌溶解提取温度为56°C。3. 根据权利要求1所述的，其特征在 于，步骤（2)所述的蒸馏水提取温度为80°C。4. 根据权利要求1所述的，其特征在 于，步骤（5)中乙醇浸膏与乙酸乙酯的比例为1:2-4。【专利摘要】本专利技术提供了一种抑制破骨细胞形成的葛根有效部位及其提取方法。本专利技术葛根有效部位的提取方法为：取干燥葛根中加入2-5倍量的蒸馏水提取2次，合并滤液；滤液旋转蒸发水分，得滤饼；滤饼中加入2-10倍量的60-70%乙醇，搅拌溶解提取2-3次，过滤，合并滤液，回收乙醇，得乙醇浸膏；乙醇浸膏中，加入1倍体积的蒸馏水热溶，用乙酸乙酯萃取2-3次，合并滤液，回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏；乙酸乙酯浸膏冷冻干燥，得粉末状葛根有效部位。本专利技术的葛根有效部位提取方法简单，得到的葛根有效部位具有显著的破骨细胞形成抑制作用。本专利技术的葛根有效部位来源于天然药物，副作用少，使用安全。【IPC分类】A61K36-488, A61P19-10【公开号】CN104547012【申请号】CN201310500319【专利技术人】秦宏佳 【申请人】大连市沙河口区中小微企业服务中心【公开日】2015本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葛根中提取抑制破骨细胞形成有效部位的方法，包括如下步骤：（1）取干燥葛根，切成厚度为1‑3mm的小片；（2）加入2‑5倍量的蒸馏水提取2次，合并滤液；（3）滤液旋转蒸发水分，得滤饼；（4）滤饼中加入2‑10倍量的60‑70%乙醇，搅拌溶解提取2‑3次，过滤，合并滤液，回收乙醇，得乙醇浸膏；（5）乙醇浸膏中，加入1倍体积的蒸馏水热溶，用乙酸乙酯萃取2‑3次，合并滤液，回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏；（6）乙酸乙酯浸膏冷冻干燥，得粉末状葛根有效部位。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：秦宏佳，
申请(专利权)人：大连市沙河口区中小微企业服务中心，
类型：发明
国别省市：辽宁;21