生物反应芯片及其在PCR反应中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种生物反应芯片及其在PCR反应中的应用。所涉及的生物反应芯片包括主体板，所述主体板上开设有多级反应槽，每级反应槽中可容纳生物反应试剂的量不同。将多级反应槽按可容纳生物反应试剂的量从大到小排序，相邻级的反应槽可容纳生物反应试剂的体积量比为定值。本发明专利技术提供的生物反应芯片在进行PCR反应定量检测时无需定量标准品，可以进行溶液核酸浓度的定量检测，实现对核酸分子进行绝对定量检测。

【技术实现步骤摘要】
生物反应芯片及其在PCR反应中的应用
本专利技术涉及生化领域试验用仪器，具体涉及一种生物反应芯片及其在PCR反应中的应用。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种简单、高效、特异性强的分子生物学检测方法。经过30多年的发展已经衍生出了多种多样的扩增流程，如实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、指数后线性扩增PCR技术(LATE-PCR)等。这些技术的产生和发展，使得PCR技术逐步成为分子生物学应用最为广泛的技术之一，特别是在病原微生物鉴定方面，实现了快速而又高特异性鉴别。因此，在各卫生防疫部门、检验检疫中心实验室广泛配置了PCR定量装置。然而，类似实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)的定量体系，必须使用标准品，进行的是相对于标准品浓度的相对定量，而且由于检测精密度要求高，荧光定量检测系统设备昂贵、环境要求高。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷或不足，本专利技术的目的之一是提供一种生物反应芯片。为此，本专利技术提供的生物反应芯片包括主体板，所述主体板上开设有多级反应槽，每级反应槽中可容纳生物反应试剂的量不同。进一步，将多级反应槽按可容纳生物反应试剂的量从大到小排序，相邻级的反应槽可容纳生物反应试剂的体积量比为定值。优选的，相邻级的反应槽可容纳生物反应试剂的体积量比大于等于5。更优选的，相邻级的反应槽可容纳生物反应试剂的体积量比为5-20。更进一步，每级反应槽包括若干个单体反应槽，且每级反应槽包括的单体反应槽个数相同或不同，同一级反应槽中的若干个单体反应槽之间相互独立且彼此可容纳的生物反应试剂的量相同。可选的，每级反应槽中单体反应槽的个数为5-20。一般相邻级的反应槽体积量比越小每级反应槽个数取值越大。针对现有技术的缺陷或不足，本专利技术的目的之二是提供上述生物反应芯片在PCR反应中的应用。针对现有技术的缺陷或不足，本专利技术的目的之三是提供上述生物反应芯片在PCR反应绝对定量检测中的应用。为此，本专利技术提供的生物反应芯片在PCR反应定量检测中的应用包括：将待测样品和PCR反应试剂装载在上述生物反应芯片中进行PCR扩增反应后，读取数据和计算待测样品中被测物质的含量；所述读取数据为读取每级反应槽中呈阳性的单体反应槽的个数，其中第i级反应槽中呈阳性的单体反应槽的个数为ai，i＝1,2,3,…,I；I≥2，ai≥1；利用(式1)计算待测样品中被测物质的含量C：(式1)其中：vi为第i级反应槽的单体反应槽的体积，vi取值范围：1nL-100uL；ni为第i级反应槽的单体反应槽的个数，ni≥2。所述的待测样品为病原微生物核酸。待测样品中被测物质含量的校准值Creal为：Creal＝C·Rs，其中Rs为PCR反应的最小检出限。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1、本专利技术提供的生物反应芯片无需定量标准品，可以进行溶液核酸浓度的定量检测。2、利用本专利技术的生物反应芯片进行定量检测时，定量检测的浓度由检测数值直接获得，因此为溶液核酸的绝对浓度。与现有技术依赖定量标准品所获得的相对溶液浓度值相比，具有更高的可靠性。3、本专利技术提供的生物反应芯片，与现有PCR定量检测技术相比具有装置小、便携性强、检测速度快的优点。附图说明图1为实施例1提供的生物反应芯片的结构示意图(单位：毫米)；图2为实施例2的方法流程示意图；图3为对比例的结果对比分析图；该图中的CHIP表示本专利技术芯片的校正前结果C，CHIPCOR表示本专利技术芯片的校正后结果Creal，两者相差RS倍。具体实施方式本专利技术的主体板的材质为可以用于生物反应的材质，例如PDMS(Polydimethylsiloxane)。可选的，PDMS材质的芯片制成后，采用臭氧等离子进行表面处理，使之表面具有亲水性，有利于样本和PCR反应液进入反应孔。可选的，本专利技术的主体板为圆形板、三角形板、方形板或椭圆形板以及中心对称的板型。可选的，本专利技术的单体反应槽为圆形反应槽或方形反应槽。进一步可选的，本专利技术的主体板为圆形板，所述单体反应槽为圆形反应槽。本专利技术的主体板上开设有至少两级反应槽。本专利技术提供的上述生物反应芯片在PCR反应中的应用包括：将生物反应试剂装载于生物反应芯片的各级反应槽中，且各级反应槽的装载量为饱和状态(装满)；在设有反应槽的主体板面上加盖反应盖；将装载有生物反应试剂和加盖有反应盖的芯片置于合适的温度下进行PCR扩增反应。可选的，将生物反应芯片置于离心镀膜机上，将足够量生物反应试剂置于主体板上，通过离心镀膜机的离心作用将生物反应试剂装载于各级反应槽中。可选的，所述主体板的底面贴有封闭薄膜。可选的，所述反应盖为表面涂覆有PDMS的载玻片。可选的，所述封闭薄膜为PC防水材料。本专利技术的生物反应芯片适用于其他任何PCR衍生流程，包括荧光PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)、指数后线性扩增PCR技术(LATE-PCR)等。本专利技术所述的最小检出限Rs取决于扩增方法(PCR衍生流程)有关系，Rs的取值范围一般是是大于等于1小于等于10。具体如使用环介导等温扩增技术(LAMP)Rs为1到5，指数后线性扩增PCR技术(LATE-PCR)Rs为5左右，荧光PCR技术Rs为10左右。例如：采用已定量的乙肝核酸标准品(1000copies/mL)梯度稀释，使用拟采用的扩增方法(LAMP)和试剂体系进行等体积批量扩增(10uL)(浓度较小、稀释可能有误差，每一种浓度都扩增2个8连管，共16管)，取观察能够到的最小浓度为Rs。本专利技术(式1)推导过程如下：设生物反应芯片中由内到外分为多级反应槽(反应槽的级数大于等于2，一般其取值越大，精度越大)，每级有若干个反应体积相同的单体反应槽,芯片上所有单体反应槽体积之和为V。在检测灵敏度Rs范围内，溶液体积V(V表示所有孔中溶液的总体积)中只有一个核酸分子，且不在一个孔内(第i级第j孔)的概率为：vij表示第i级第j孔的体积。假设有k个核酸分子在V体积的溶液内，因此，样品溶液的绝对浓度为：一个孔内(第i级第j孔)不含有任何核酸分子的概率为：因此，该孔(第i级第j孔)为PCR扩增阳性孔的概率为：一般地，在第i级的n个单体反应槽中，获得a个PCR扩增阳性孔的概率，可由二项分布计算公式得出概率密度f(a|k)：因为当溶液总体积V远大于单体反应槽中的溶液体积vij时，可以由上述公式中推导得出：当考虑所有反应级别中，对应的阳性孔数量ai(i＝1,2,…,m)发生的概率密度的最大似然估计，可以得到最大似然函数关于样品液浓度C的方程：对L(C)求偏微分，该样品最大似然浓度(C,ConcentrationofMaximumLikelihood)为L(C)导函数为0时的根，L(C)·＝0即下面方程C的解：又因为反应芯片反应槽溶液总体积V可表示为：方程(1)可简化为：如果认为样品的最小检出限Rs为1个核酸分子，那么绝对核酸浓度C即为该方程的解。如果考虑各PCR试剂的灵敏度，即最小检出限Rs，那么样品的绝对核酸浓度修正为：Creal＝C·Rs以下是专利技术人提供的具体实施例，以对本专利技术的技术方案作进一步解释说明。实施例1：该实施例的生物反应芯片的主体板材质为PDMS(Polydimethylsiloxane)，芯片采用已有文献报道的硅片光刻蚀法制作，结构示意图如图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物反应芯片，包括主体板，其特征在于，所述主体板上开设有多级反应槽，每级反应槽中可容纳生物反应试剂的量不同。

【技术特征摘要】
1.一种乙肝病毒PCR绝对定量检测方法，其特征在于，方法采用生物反应芯片对乙肝HBV-DNA样品进行PCR绝对定量检测，所述生物反应芯片包括主体板，所述主体板的直径为46mm、厚度为300μm，所述主体板上刻蚀有6级反应槽，且各级反应槽在主体板上呈圆周分布，同一级反应槽中的多个单体反应槽呈等间距圆周式分布，且沿主体板的径向从主体板边缘至中心，各级反应槽的单体反应槽直径逐渐减小，各级单体反应槽的直径：7.28mm、2.37mm、0.72mm、0.22mm、0.07mm、0.02mm；每个单体反应槽的深度均为40μm；各级单体反应槽的个数：10个、20个、20个、20个、20个、20个；各级单体反应槽体积：1.655μL、1.76E-01μL、1.63E-02μL、1.52E-03μL、1.54E-04μL、1.26E-05μL；检测体系包括：20mMTris-HCl,10mMKCl,10mM(NH4)2SO4,9mMMgSO4,1.4mMdNTP,0.8MBetain,8UIBstDNAPolymerase；引物为：外引物一对F3/B3和内引物一对FIP(F1c+F2)/BIP(B1c+B2)，引物终浓度为F3/B30.2μM,FIP/BIP1.6μM；F3:5’-CACGGGACCATGCAAGAC-3’；B3:5’-AAACAGTGGGGGAAAGCC-3’；FIP:5’-TGCAGTTTCCGTCCGAAGGTTT-CTGCACGATTCCTGCTCAA-3’；BIP:5’-CG...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫永平，高洁，王波，肖丹，张磊，王安辉，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61