非线性结构光照明显微成像方法及系统技术方案

本发明专利技术公开了一种非线性结构光照明显微成像方法，其包括以下步骤：1)在所述数字微镜阵列上加载计算全息图；2)产生满足正弦分布的用于激活荧光蛋白的第一空间结构光场，第一空间结构光场照射到样品表面，使部分蛋白从暗态转换到亮态；3)第二空间结构光场照射样品，使处于亮态的荧光蛋白发荧光，并收集荧光，在光电探测器中成像；4)重复第2)和3)步骤，采集多个空间频率，每个方向采集多个初始位相，得到多张原始图像，并根据GPU加速算法重构超分辨图像。同时，本发明专利技术还公开了一种非线性结构光照明显微成像系统。本发明专利技术具有系统成像分辨率较高、高抗荧光漂泊、低光毒性、成像速度快的优点。

【技术实现步骤摘要】
非线性结构光照明显微成像方法及系统
本专利技术涉及生物成像领域，具体涉及一种非线性结构光照明显微成像方法及系统。
技术介绍
生物成像是涉及多学科交叉的生命科学前沿领域，通过在分子-细胞-组织-活体等不同层次上实时、动态地“看”到活细胞的相互作用来研究生物学功能的各种成像尖端技术已成为当今生命科学重大成果产生的突破口。传统的光学显微镜受到光学衍射极限的限制，其衍射光斑(艾里斑)的大小约为光源波长与显微镜物镜数值孔径比值的一半，一般最高的成像分辨率在200-300nm左右，无法直接观察一些重要分子如基因、结构蛋白、免疫蛋白、RNA及其复合物、活性因子等是如何在细胞内得到表达、如何组成细胞的基本结构体系，如何调节细胞的主要生命活动，如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡与细胞信号传递等。反映这些体系性质的特征尺度都在纳米的量级。电子显微镜(EM)能够达到纳米数量级的分辨率，能够对细胞内部囊泡、线粒体等细胞器的定位，但是由于缺乏相应的探针标记，不适合定位单个蛋白质分子。电子显微镜样品需要固定，同时电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤，因此不适合进行活细胞动态变化的观察。分辨率达到亚微米甚至纳米分辨率的超分辨光学显微技术能够克服传统光学显微镜和电子显微镜的缺陷，突破衍射极限，实现在细胞水平上的超分辨成像能力。超分辨光学显微技术主要包括三大类：1、基于荧光单分子定位的光敏定位显微技术(photo-activatedlocalizationmicroscopy，简称PALM)和随机光学重构显微技术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy，简称STORM)；2、通过改变点扩散函数的受激发射损耗显微技术(stimulatedemissiondepletion，简称STED)；3、使用结构光照明激发荧光的结构照明显微技术(structuredilluminationmicroscopy，简称SIM)。PALM/STORM的成像原理相同，都是利用荧光分子的随机逐个激发发射荧光光子，通过点扩散函数数字化获得其中心位置，从而突破光波衍射现象对成像分辨率的限制。尽管PALM/STORM采用面探测成像，但每次只对少量荧光分子成像，需要反复激活-淬灭荧光分子进行成像，要获得一幅完整的细胞超分辨图像，一般需要采集1万张图像，数据量大，成像时间很长，这使得实验大多数在固定的细胞上完成，无法进行活细胞研究。STED成像过程中，用一束激发光使荧光物质发光，同时用另外的高能量脉冲激光器发射一束重叠的、环型的、波长较长的激光将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程淬灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨率。然而由于STED需要采用高强度激光(50-70纳米分辨率时所需峰值功率为400～800MW/cm2，5.8纳米分辨率时所需激光功率密度达到GW/cm2量级)，高功率激光容易造成生物组织损伤，极大地制约了STED的应用范围。SIM利用调制光源照明样品，照明光和荧光在频域发生混频、移频，将原本不可分辨的高分辨率信息编码入荧光图像中，结合计算解码快速傅立叶变换获取高分辨率信息。然而由于照明光场本身也同样受到系统衍射极限的限制，理论上SIM最大可将分辨率提高约一倍，横向分辨率达到约100-150nm。2005年Gustafsson.etal.[PNAS，102：13801(2005)]提出一种非线性结构光照明超分辨成像方法(NL-SIM)，利用荧光分子的饱和非线性特性，可获取样品的高频信息，理论上可实现任意高分辨率的荧光成像，然而为了实现饱和非线性荧光发射，需要很高的激发光功率密度，容易造成生物组织损伤，同时由于NL-SIM需要采集数倍于SIM的数据才能重构出一张超分辨图像，成像速度慢，这些问题限制了NL-SIM在生物医学领域的实际应用。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种非线性结构光照明显微成像方法及系统，其通过低功率密度的空间结构光场激活荧光标记样品，再使用与激活光场相位的空间结构光场激发荧光并采集成像，可使实现3倍光学截止频率成像，成像横向分辨率达到60纳米，系统具有良好的机械稳定，其中Z向漂移低于5纳米/小时，图像采集速度达到100Hz，能够实现对活细胞超分辨成像。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：非线性结构光照明显微成像方法，其包括以下步骤：1)令数字微镜阵列工作在锁定模式，在数字微镜阵列上加载计算全息图，计算全息图的透过率函数为：其中γ表示调制度，k0表示空间频率，表示初始相位；2)令空间均匀分布的第一激光照射到数字微镜阵列上，第一激光被数字显微镜阵列上的全息光栅衍射到各个级次，各个级次的光在透镜构成的系统的傅立叶面滤波后，选择其中的一对正负一级衍射光，一对正负一级衍射光依次通过透镜和显微物镜，照射到样品表面，使正负一级衍射光在样品的蛋白表面发生干涉，产生满足正弦分布的用于激活荧光蛋白的第一空间结构光场，第一空间结构光场照射到样品表面，使部分蛋白从暗态转换到亮态；3)使用波长大于第2)步中的第一激光的第二激光来重复步骤2)，得到满足正弦分布的用于激发荧光蛋白的第二空间结构光场，使用第二空间结构光场照射样品，使处于亮态的荧光蛋白发荧光，并收集荧光，在光电探测器中成像；4)改变数字微阵列上加载的计算全息图，重复第2)和3)步骤，采集多个空间频率，每个方向采集多个初始位相，得到多张原始图像，最后用GPU加速算法，根据的多张原始图像重构超分辨图像。优选地，在步骤4)中，在采用GPU加速算法根据多张原始图像重构超分辨图像之前还包括步骤：判断全部光栅是否均已加载并成像：若否，返回步骤2)；若是，判断多个波长窗口是否均已成像：若否，仍然返回步骤2)；若是，关闭数字显微镜阵列，停止采集图像，GPU加速重构图像。优选地，在上述的步骤2)中，透镜构成的系统为4F系统，各个级次的光在4F系统的傅立叶面进行滤波。优选地，上述的第一空间结构光场和第二空间结构光场具有相同的位相。优选地，上述的一对正负一级衍射光为一对相干光束对。非线性结构光照明显微成像系统，其包括：光源系统(1)，其包括至少两个波长不同的激光器(11、12)、至少两个中性滤波片(15、16)、至少两个半波片(19、110)、至少两个二向色镜(113、114)、声光可调滤波器(117)、光纤耦合器(118)和高频振动台(119)，激光器(11、12)中至少有一个作为激活光源，至少有另一个作为激发光源，作为激活光源的激光器发出的激光和从作为激发光源的激光器发出的激光，分别依次通过中性滤波片(15、16)、半波片(19、110)、二向色镜(113、114)、声光可调滤波器(117)、光纤耦合器(118)和高频振动台(119)，最终得到在同一根光纤中传播的至少一束激活光束和至少一束激发光束；衍射系统(2)，至少一束激活光束和至少一束激发光束分别依次经过衍射系统中沿光路依次放置的光纤耦合器(21)、透镜(22)、反射镜(23)、数字微镜阵列(24)、透镜(25)、强度掩模(26)、透镜(27)、反射镜(28)和透镜(29)，每束光均得到一对对应的正负一级衍射光；成像系统(3)，衍射系统(2)产生的激活光束对应的第一本文档来自技高网...

【技术保护点】
非线性结构光照明显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：1)令数字微镜阵列工作在锁定模式，在所述数字微镜阵列上加载计算全息图，所述计算全息图的透过率函数为：其中γ表示调制度，k0表示空间频率，表示初始相位；2)令空间均匀分布的第一激光照射到所述数字微镜阵列上，所述第一激光被所述数字显微镜阵列上的全息光栅衍射到各个级次，所述各个级次的光在透镜构成的系统的傅立叶面滤波后，选择其中的一对正负一级衍射光，所述一对正负一级衍射光依次通过透镜和显微物镜，照射到样品表面，使所述正负一级衍射光在样品的蛋白表面发生干涉，产生满足正弦分布的用于激活荧光蛋白的第一空间结构光场，所述第一空间结构光场照射到样品表面，使部分蛋白从暗态转换到亮态；3)使用波长大于第2)步中的所述第一激光的第二激光来重复步骤2)，得到满足正弦分布的用于激发荧光蛋白的第二空间结构光场，使用所述第二空间结构光场照射样品，使处于亮态的荧光蛋白发荧光，并收集荧光，在光电探测器中成像；4)改变所述数字微阵列上加载的所述计算全息图，重复第2)和3)步骤，采集多个空间频率，每个方向采集多个初始位相，得到多张原始图像，最后用GPU加速算法，根据所述的多张原始图像重构超分辨图像。...

【技术特征摘要】
1.非线性结构光照明显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：1)令数字微镜阵列工作在锁定模式，在所述数字微镜阵列上加载计算全息图，所述计算全息图的透过率函数为：其中γ表示调制度，k0表示空间频率，表示初始位相，r表示透过率；2)令空间均匀分布的第一激光照射到所述数字微镜阵列上，所述第一激光被所述数字微镜阵列上的全息光栅衍射到各个级次，所述各个级次的光在透镜构成的系统的傅立叶面滤波后，选择其中的一对正负一级衍射光，所述一对正负一级衍射光依次通过透镜和显微物镜，照射到样品表面，使所述正负一级衍射光在样品的蛋白表面发生干涉，产生满足正弦分布的用于激活荧光蛋白的第一空间结构光场，所述第一空间结构光场照射到样品表面，使部分蛋白从暗态转换到亮态；3)使用波长大于第2)步中的所述第一激光的第二激光来重复步骤2)，得到满足正弦分布的用于激发荧光蛋白的第二空间结构光场，使用所述第二空间结构光场照射样品，使处于亮态的荧光蛋白发荧光，并收集荧光，在光电探测器中成像；4)改变所述数字微镜阵列上加载的所述计算全息图，重复第2)和3)步骤，采集多个空间频率，每个条纹方向采集多个初始位相，得到多张原始图像，最后用GPU加速算法，根据所述的多张原始图像重构超分辨图像。2.根据权利要求1所述的非线性结构光照明显微成像方法，其特征在于，在所述步骤4)中，在采用所述GPU加速算法根据所述多张原始图像重构超分辨图像之前还包括步骤：判断全部光栅是否均已加载并成像：若否，返回步骤2)；若是，判断多个波长窗口是否均已成像：若否，仍然返回步骤2)；若是，关闭所述数字微镜阵列，停止采集图像，GPU加速重构图像。3.根据权利要求1所述的非线性结构光照明显微成像方法，其特征在于，在所述步骤2)中，所述透镜构成的系统为4F系统，所述各个级次的光在所述4F系统的傅立叶面进行滤波。4.根据权利要求1所述的非线性结构光照明显微成像方法，其特征在于，所述第一空间结构光场和所述第二空间结构光场具有相同的位相。5.根据权利要求1所述的非线性结构光照明显微成像方法，其特征在于，所述一对正负一级衍射光为一对相干光束对。6.非线性结构光照明显微成像系统，其特征在于，包括：光源系统(1)，其包括至少两个波长不同的激光器(11、12)、至少两个中性滤波片(15、16)、至少两个半波片(19、110)、至少两个二向色镜(113、114)、声光可调滤波器(117)、光纤耦合器(118)和高频振动台(119)，所述激光器(11、12)中至少有一个作为激活光源，至少有另一个作为激...

【专利技术属性】
技术研发人员：李思黾，李辉，杨西斌，杨光，梁永，熊大曦，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32