本发明专利技术公开了能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应用，构建方法步骤为：①将拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因AtCPR1的5’端的前138个碱基切除，得到SEQ ID NO.2所示序列；②将以SEQ ID NO.3所示的人参中原人参二醇合酶基因PPDS的3’端终止密码子TAA去除，与SEQ ID NO.2所示序列的5’端用编码多肽GSTSSG的碱基序列连接，构建出融合蛋白质的基因元件；③将融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子和终止子连接，构建融合蛋白质基因表达盒，并转化进入酿酒酵母细胞表达。本发明专利技术构建的融合蛋白质能使达玛烯二醇到原人参二醇的转化效率提高。
【技术实现步骤摘要】
能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应 用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及 构建方法及应用。
技术介绍
人参皂苷是中药人参的主要活性成分，具有保护心血管，抗疲劳，抗衰老和抗癌的 药理作用。传统的人参栽培、组织培养和下游的植物组织提取已很难满足市场对人参皂苷 的需求。 作为一种三萜类化合物，酿酒酵母内源代谢途径可为人参皂苷的合成提供前体 2, 3-氧化鲨烯。随后的环氧化、氧化以及糖基添加分别由达玛烯二醇合成酶、原人参二醇 合成酶和糖基转移酶完成。达玛烯二醇合成酶基因于2006年被发现。Tansakul等报道 PNA(DDBJ数据库，序号AB265170)是催化达玛烯二醇合成的基因。Han等报道了另外一个 DDS(DDBJ/EMBL/GenBanK 数据库，序号 AB122080)。2011 年，Jung-Yeon Han 等通过对茉莉 酸甲酯诱导的人参不定根进行cDNA建库，对转录组测序后经过一系列筛选，确定PPDS基因 (Cyp716a47)编码原人参二醇合成酶。2014年，GT的筛选也取得一定的进展，周志华等综 合已发表的人参转录组的信息，筛选出能将原人参二醇转化为人参皂苷compound K(CK)的 糖基转移酶。 基于以上人参皂苷合成途径中相关基因的挖掘，张学礼对酿酒酵母进行工程化， 引入DS、PPDS和拟南芥中的AtCPRl，并对酿酒酵母甲羟戊酸途径限速过程进行过表达，构 建了产原人参二醇的人工酿酒酵母细胞。周志华将筛选到的GT基因植入酿酒酵母中，得到 了能产CK的酿酒酵母细胞。 PPDS是一种细胞色素P450单加氧酶。前期的研究发现，在人工构建的原人参二醇 酿酒酵母合成途径中，PPDS是一个限速的步骤，单纯的增加PPDS及其还原酶的拷贝并不能 解决问题，致使达玛烯二醇的转化效率相对较低。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供能提高达玛烯二醇转化效率的融合 蛋白质。 本专利技术的第二个目的是提供能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建方 法。 本专利技术的第三个目的是提供能提高达玛烯二醇转化效率融合蛋白质的应用。 本专利技术的技术方案概述如下： 能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建方法，包括如下步骤： ①将拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因AtCPRl的5'端的前138个碱基切 除，得到SEQ ID N0. 2所示序列，所述拟南芥中AtCPRl基因以SEQ ID NO. 1所示； ②将以SEQ ID NO. 3所示的人参中原人参二醇合酶基因PPDS的3'端终止密码 子TAA去除，与SEQ ID N0. 2所示序列的5'端用编码多肽GSTSSG的碱基序列连接，构建出 PPDS-linker2-AtCPRl融合蛋白质的基因元件； ③将PPDS-linker2-AtCPRl融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子 和终止子连接，构建PPDS-linker2-AtCPRl融合蛋白质基因表达盒，并转化进入酿酒酵母 细胞表达。 上述方法构建的能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质。 上述融合蛋白质在酿酒酵母中合成人参皂苷中的应用。 所述GSTSSG的碱基序列如5' -GGTTCTACTTCTTCAGGT-3'，但不仅限于此序列。 所述酿酒酵母内源启动子如PGKlp (磷酸甘油酸激酶1启动子），序列SEQ ID NO. 7。 所述酿酒酵母内源终止子如ADH3t (乙醇脱氢酶3)序列SEQ ID NO. 12. SEQ ID NO. 1所示的AtCPRl基因序列为拟南芥NADPH-细胞色素P450还原酶1的 基因针对酿酒酵母的密码子的优化序列。 SEQ ID N0. 2所示的基因序列为序列SEQ ID NO. 1去除前138bp后得到。 SEQ ID N0. 3所示的PPDS基因序列为人参中原人参二醇合成酶的基因针对酿酒酵 母的密码子的优化序列。 本专利技术的优点： 实验证明，本专利技术构建的能提高达玛烯二醇转化效率的PPDS-linker2_AtCPRl融 合蛋白质在酿酒酵母中比单独存在的PPDS和AtCPRl催化效率高。这种构建方法得到的融 合蛋白提高了达玛烯二醇的转化效率，有利于人参皂苷在微生物中的高效合成。 【附图说明】 图 1. PGKlp-PPDS-linker2-AtCPRl-ADH3t 融合模块电泳图。 图2. PPDS和AtCPRl蛋白质在酿酒酵母细胞内的示意图。图2A为自然条件下两 种蛋白质在酿酒酵母细胞内的示意图；图2B为本专利技术所构建的PPDS-linker2-AtCPRl融合 蛋白质在酿酒酵母细胞内的不意图。 图3.达玛烯二醇和原人参二醇LC-MS分析。 图4?自然条件下PPDS和AtCPRl与PPDS-linker2-AtCPRl融合蛋白催化能力对 比。 图5.各菌株达玛烯二醇和原人参二醇的产量对比。 【具体实施方式】 下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。 下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 实施例1 合成达玛烯二醇酿酒酵母细胞的构建 一、模块构建 根据人参中达玛烯二醇合酶的氨基酸序列，进行针对酿酒酵母的密码子优化，然 后通过化学合成的方法（金唯智生物科技有限公司合成）得到编码达玛烯二醇合成酶的基 因05为5￡〇10勵.4;酿酒酵母内源的七腿61(5￡〇10勵.5)，6找1(5￡〇10勵.6)，以及启动 NO. 10)，ADHlt(SEQ ID NO. ll)，ADH3t(SEQ ID N0. 12)均来自酿酒酵母w303-la基因组；筛 选标记基因leu2来自质粒prs405(美国ATCC)，his3来自质粒pxp320 (购自Addgene, Inc. WWW. addgene. org)〇 以酿酒酵母W303-la(美国，ATCC)基因组为模板，以PGKlp-DS-F(SEQ ID NO. 13) (和卩61(让-〇5-1?(5￡〇10勵.14)以及05-〇￥(：1卜卩(5￡〇10勵.17)和05-〇￥(：1卜1?(5￡〇10 NO. 18)为引物，分别扩增PGKlp启动子和CYClt终止子。 以达玛烯二醇合成酶的基因DS(SEQ ID N0. 4)为模板，以DS-F(SEQ ID N0. 15)和 DS-R(SEQ ID NO. 16)为引物扩增DS基因。将PGKlp启动子、DS基因和CYClt终止子用融 合PCR的方法融合成DS的表达模块PGKlp-DS-CYClt ;以酿酒酵母W303-la基因组为模板， ID N0. 23)和ergl-ADHlt-R(SEQ ID N0. 24)为引物，分别扩增TEFlp启动子和ADHlt终止 子。 以 W303-la 基因组为模板，以 ergl-F(SEQ IDN0.21)和 ergl-R(SEQ IDN0.22) 为引物扩增ergl基因片段。将TEFlp启动子、ergl基因片段和AD本文档来自技高网...
【技术保护点】
能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建方法，其特征是包括如下步骤：①将拟南芥中细胞色素‑NADPH‑还原酶1基因AtCPR1的5’端的前138个碱基切除，得到SEQ ID NO.2所示序列，所述拟南芥中AtCPR1基因以SEQ ID NO.1所示；②将以SEQ ID NO.3所示的人参中原人参二醇合酶基因PPDS的3’端终止密码子TAA去除，与SEQ ID NO.2所示序列的5’端用编码多肽GSTSSG的碱基序列连接，构建出PPDS‑linker2‑AtCPR1融合蛋白质的基因元件；③将PPDS‑linker2‑AtCPR1融合蛋白质的基因元件与酿酒酵母细胞内源启动子和终止子连接，构建PPDS‑linker2‑AtCPR1融合蛋白质基因表达盒，并转化进入酿酒酵母细胞表达。
【技术特征摘要】
1. 能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质的构建方法，其特征是包括如下步骤： ① 将拟南芥中细胞色素-NADPH-还原酶1基因 AtCPRl的5'端的前138个碱基切除， 得到SEQ ID NO. 2所示序列，所述拟南芥中AtCPRl基因以SEQ ID NO. 1所示； ② 将以SEQ ID NO. 3所示的人参中原人参二醇合酶基因 PPDS的3'端终止密码子 TAA去除，与SEQ ID NO. 2所示序列的5'端用编码...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢文玉，赵方龙，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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