重组固氮细菌菌株、含有所述菌株的接种物以及应用方法技术

重组细菌菌株，所述重组细菌菌株在其基因组中包含异源nif基因并且能够固氮。所述菌株可以是例如在其基因组中包含异源nif基因的重组荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株。还描述了用于提高植物生产力的接种物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组固氮细菌菌株、含有所述菌株的接种物以及应用方法本申请涉及重组固氮(nitrogen-fixing)细菌菌株、含有所述菌株的接种物(inoculum)和应用方法。更具体地，其涉及包含异源nif基因并且能够固氮的重组细菌菌株。
技术介绍
已经描述了两种旨在改进在氮缺乏土壤中生长之植物的生产力的处理/技术：(a)用含氮化合物(例如尿素)施肥以及(b)用固氮细菌接种。存在两种类型的固氮细菌：(b1)共生细菌，其与豆科植物联合固氮(例如根瘤菌属(Rhizobiumsp.)和中华根瘤菌属(Sinorhizobiumsp.))和(b2)独立生存的固氮细菌(例如巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)和棕色固氮菌(Azotobactervinelandii))。使用第一种类型成功地改进了在氮贫乏的土壤中生长之农作物的生产力，但其仅适用于豆科植物。第二种类型可以用于所有类型的植物(不仅针对豆科植物)。然而，还没有表明由这些细菌固定的氮足以克服在氮贫乏的土壤中生长之植物所遭受的氮缺乏。尽管这样，目前在接种物的制备中使用例如巴西固氮螺菌(A.brasilense)和棕色固氮菌(A.vinelandii)的种，因为这样的细菌产生能够刺激根发育的植物激素。这是农学上重要的特性，但其与这些细菌的固氮能力没有关系。专利申请EP0108508描述了用固氮相关基因修饰的大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株。然而，该大肠杆菌(E.coli)菌株不用于改进在氮贫乏的土壤中生长之植物的生产力，而是为了将固氮能力转移到其他微生物(例如大豆根瘤菌(Rhizobiumjaponicum))。专利技术概述本专利技术的一个主题是提供细菌菌株，例如包含nif基因的重组荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。这样的菌株将能够固氮并且已经用黏粒X940转化。在一个优选的实施方案中，重组菌株包含PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因；PST_1307至PST_1312基因已经被缺失或替换，已经插入了来自质粒pUC4K(X06404)的卡那霉素抗性基因。对PST基因的描述可参见下列网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000304.1和http：//www.biomedcentral.com/1471-2164/11/11。在一个优选的实施方案中，重组荧光假单胞菌菌株包含PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因以及卡那霉素抗性基因。对于从业人员(expert)而言明显的是，在所提供的实例的基础上，任何人可通过使用本文所述的微生物转化和构建技术从不固氮的菌株获得不同的固氮细菌菌株和种。因此，用异源nif基因转化的形成固氮能力的任何细菌菌株或种落入本专利技术的范围内。nif基因可以是任何已知和公开的那些，例如在下列网址上公开的PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000304.1和http：//www.biomedcentral.com/1471-2164/11/11。基于可从本申请学到的，可将这样的基因引入不固氮的细菌并且将它们转化成固氮细菌，此外这高效地改进植物生产力。本专利技术的另一个主题是提供旨在改进植物生产力的接种物，其包含重组细菌(例如荧光假单胞菌)，伴随这种菌株包含异源nif基因和载剂。所述接种物可以包含8.108-2.109个细胞/ml。基于从所提供的实例可得知的，从业人员可通过使用本专利技术的重组细菌制备不同的接种物，所有所述接种物落入本专利技术的范围内。本专利技术的另一个主题是提供改进植物中固氮的方法，其需要用含有异源nif基因的这种细菌向土壤施加包含1.6108至4108之量的重组细菌(例如荧光假单胞菌)。在一个优选的实施方案中，所述重组细菌菌株包含PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因；而PST_1307至PST_1312基因已经被缺失或替换，已经插入了卡那霉素抗性基因，例如来自质粒pUC4K(X06404)的抗性基因。所述植物可以是已知的任何一种，例如单子叶植物或双子叶植物。在一个优选的实施方案中，所述方法包括向土壤每升土壤体积施加包含1.6108至4108之量的重组细菌(例如荧光假单胞菌)。如可观察到的，所述方法可应用至任何种类的植物和氮贫乏的土壤。附图说明图1：图1示出用黏粒X940转化假单胞菌(Pseudomonas)Pf-5的影响。有盖的锥形瓶(Erlenmeyerflask)模拟微需氧生活(microaerobiosis)条件并且封口膜(Parafilm)密封的锥形瓶模拟需氧生活(aerobiosis)条件。采用的统计学分析为ANOVA，继之进行Tukey对比。字母指比较性处理。相同的字母指统计学上没有显著性差异。a和b示出具有p＜0.01的显著性差异。图2：图2示出在存在或不存在氮的基质中，接种Pf-5X940对苜蓿植株之生长的影响。采用的统计学分析为ANOVA，继之进行Tukey对比。在不同氮条件下在基质中接受相同接种处理的植物间进行比较。＊＊p＜0.01且＊＊＊p＜0.001。图3：图3示出在存在或不存在氮的基质中，接种Pf-5X940对拟南芥莲座叶(Arabidopsisrosette)尺寸的影响。采用的统计学分析为ANOVA，继之进行Tukey对比。在不同氮条件下在基质中接受相同接种处理的植物间进行比较。＊＊p＜0.01且＊＊＊p＜0.001，N.S.：不显著。图4：图4示出在存在或不存在氮的基质中，接种Pf-5X940对高羊茅(TallFescue)之第一叶宽度的影响。采用的统计学分析为ANOVA，继之进行Tukey对比。在不同氮条件下在基质中接受相同接种处理的植物间进行比较。＊＊p＜0.01且＊＊＊p＜0.001，N.S.：不显著。图5：图5示出黏粒X940的示意图。图6：图6以图解示出构建黏粒X940的过程。B：BamHI，S：SalI和M：MboI。专利技术详述作为本专利技术目标的重组固氮细菌菌株在技术上开启了质的飞跃。本申请人未了解到旨在获得通过可重复的、高效的技术(例如基因工程和转化)获得可形成固氮能力之微生物的任何技术。本专利技术接种物的可用性扩大了旨在解决由土壤中氮可用性受限造成之问题的接种物的范围(field)，因为其不仅采用天然细菌分离(非重组细菌)还采用用固定氮之nif基因转化的重组细菌，例如用施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)A1501的PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因转化的细菌。已经制备细菌菌株，例如包含例如施氏假单胞菌A1501菌株之nif基因的重组荧光假单胞菌，这种重组菌株在被携带nif基因的黏粒X940转化时能够固氮。在一个优选的实施方案中，所述菌株包含施氏假单胞菌A1501的PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因。被转化的菌株称为Pf-5X940。本专利技术陈述了重要的定量结果，因为用Pf-5X940接种导本文档来自技高网...

【技术保护点】
因而，已经描述和确定的本专利技术之本质及其应当付诸实践的方式，其排他权和所有权在此主张和要求如下：重组细菌菌株，其特征在于这样的菌株包含异源nif基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.24 AR P201101043811.用于提高植物中固氮作用的方法，其特征在于这样的方法包括向土壤施加每升土壤1.6×108至4×108的量的重组菌株，其中所述重组菌株为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株，其包含获自施氏假单胞菌(Pseudomonasstutz...

【专利技术属性】
技术研发人员：加布里埃拉·辛蒂亚·索托，尼古拉斯·丹尼尔·阿尤卜，洛雷娜·马里亚·塞滕，
申请(专利权)人：国家科学和技术研究委员会CONICET，国家农业技术研究院INTA，INIS生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：阿根廷;AR