用于HPLC检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂制造技术

本发明专利技术一种用于HPLC检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂。通过优化样品预处理方法和调整流动相配方、流动相流动速度、流动相洗脱过程、柱温、参比电压、工作电压和保护池电压等参数，可快速地、准确地和高灵敏度地检测样品中的儿茶酚胺浓度。

【技术实现步骤摘要】
用于HPLC检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂
本专利技术涉及一种检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂，尤其是涉及一种用于HPLC检 测血液或尿液中儿茶酚胺浓度的试剂。
技术介绍
儿茶酚胺（catecholamines, CAs)是一类含有儿茶酚和胺基的神经类物质，也是 人体内一类重要的信号传递物质，均是在肾上腺髓质嗜铬细胞中的β_羟化酶催化下由苯 丙氨酸和酪氨酸合成而来的。最为重要的儿茶酚胺是多巴胺（dopamine，D0P)、肾上腺素 (adrenaline, ADR)和去甲肾上腺素（noradrenaline, N0R)。不少精神兴奋剂也是儿茶酚 胺的类似物。 去甲肾上腺素和肾上腺素既是肾上腺髓质所分泌的激素，又是交感神经和中枢神 经系统中去甲肾上腺素能纤维的神经介质。去甲肾上腺素在中枢神经系统内分布广泛，含 量较多，而肾上腺素含量则较少。多巴胺主要集中在锥体外系部位，也是一种神经介质。它 们是重要的典型的肾上腺素受体激动剂。 血液中儿茶酚胺主要来源于交感神经和肾上腺髓质，它们都由尿液排出。测定24 小时尿液中儿茶酚胺浓度可反映交感神经和肾上腺髓质的功能，且有昼夜规律性变化。 血浆中儿茶酚胺生理水平很低，正常生理含量为pg( lpg=l(T12g)水平。血浆里儿茶 酚胺水平的变化显示不同的病态情形。一般通过不正常的儿茶酚胺水平能断定两个方面： 首先，涉及到肾上腺髓质瘤，这些瘤结合大量的儿茶酚胺导致循环失常；其次，涉及到心血 管系统。过多的儿茶酚胺分泌可能导致高血压和心肌梗塞，而低水平的儿茶酚胺可能引起 低血压、心肌缺血等症状的发生。儿茶酚胺含量水平的不同与心脏猝死、冠状心脏病和心脏 不充血等也有潜在联系。临床上，在神经源性、心源性、中毒源性休克的早期，医生们常用儿 茶酚胺来治疗病人以便增加收缩力和扩张外周血管改善微循环。此外，儿茶酚胺也可用于 治疗胃出血，通过在胃局部发挥作用导致胃黏膜血管收缩而产生止血效果。然而，儿茶酚胺 治疗也会产生不良反应，具体表现为：从血管漏出时会引发局部组织缺血坏死；剂量过大 时会引发急性肾功能衰竭。另外，突然停用儿茶酚胺可出现血压下降，因此需停用时，应先 逐渐减少剂量和减慢滴速，然后停止使用。 鉴于儿茶酚胺不仅直接参与行为活动以及血压，心率呼吸和睡眠等植物神经功 能调控，而且还与许多功能性疾病如神经分裂症和忧郁症以及器官性病变相关联，因此有 必要对血液和尿液中的儿茶酚胺浓度进行检测，这不仅可以用于研究它们的生理功能及其 代谢变化，而且还可用于其他与儿茶酚胺相关的疾病的研究，特别有助于原发性高血压和 嗜铬细胞瘤的鉴别诊断，同时在利用儿茶酚胺进行休克和胃出血等疾病治疗时，实时监控 病人体内的儿茶酚胺水平变化也会尽可能低降低其不良反应。 常用的儿茶酚胺检测方法包括荧光测定、分光光度检测、放射免疫测定、气相色谱 法和高效液相色谱法（HPLC)。其中，荧光测定主要涉及三羟基吲哚法，乙二胺缩合法，邻 苯二胺缩合法和2, 3-二氨基萘衍生化荧光测定法等(董捷，房刚，叶新强.儿茶酚胺类 物质的分析进展.化学分析计量，2001，10(6) :34-37)，都涉及利用加入与儿茶酚胺发生 反应的物质，从而产生荧光物质，通过检测特定波长处的荧光值来测定儿茶酚胺，但是它们 的灵敏度都不高，而且测定结果容易受到干扰物质的干扰，另外还有些方法只能检测样品 中ADR和NOR的总量，但不能检测DOP的总量。分光光度检测涉及先让样品中的儿茶酚胺 发生多种化学反应而产生颜色变化，然后利用紫外-可见光分光光度计在特定波长下检测 吸光值（Tayyebeh Madrakian, Abbas Afkhami, Lida Khalafi, et al. Spectrophotometric determination of catecholamines based on their oxidation reaction followed by coupling with 4-aminobenzoic acid. J. Braz. Chem. Soc. , 2006, 17 (7) : 1259?1265 ; J. J. Berzas Nevado, J. M. Lemus Gallego, P. Buitrago Laguna. Spectrophotometric determination of catecholamines with metaperiodate by flow-injection analysis. 1995:293-295)，该方法灵敏度不高，也容易受到样品中干扰物的 影响而导致测量结果发生偏差。放射免疫测定涉及使用放射性元素，容易对实验操作者造 成健康风险，同时也会污染环境。气相色谱法涉及把儿茶酚胺类物质制成硅烷化衍生物三 氯或五氟衍生物，然后用电子捕获器检测，虽然适合用于体液中微量儿茶酚胺类物质的分 析，但是它的缺点是需要制备衍生物，此外虽然衍生化反应速度较快，副产物不干扰测定， 但是衍生化试剂遇湿易水解。 HPLC是在经典液相色谱发展的基础上，引入了气相色谱法的理论和实验技术，以 高压输送流动相，采用高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法。比较广泛应用 的方法就是将HPLC与电化学检测法、荧光检测法、质谱法、紫外检测法的组合应用。 高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-υν)虽能分别检测D0P、ADR和N0R，但是相对而 言，灵敏度还是偏低，不能达到生物样品检测目的。高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FD) 也能分别检测DOP、ADR和N0R，并且具有较好的线性关系，但是荧光检测前处理复杂，而且 不能将这三种成分完全分开。而高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-E⑶）是将HPLC的 高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广等优点与具有高灵敏度和高选择性的电化学检测 器相结合，准确性好，灵敏度高，还具有重现性好、操作简便、离子对试剂使用量小和色谱 柱寿命长等优点，因而适用于生物组织和体液中微量儿茶酚胺的测定。因此本专利技术采用 HPLC-E⑶法进行检测样品中的儿茶酚胺。 在利用HPLC-E⑶检测诸如血液和尿液之类的样品中的儿茶酚胺时，需要配置流 动相。为了除去干扰，降低杂峰的产生，所配置的流动相中应当加入一种离子对试剂，如辛 烷磺酸钠。王忠永、陶志华和杨建荣配置的l〇〇〇ml流动相含有648mg辛烷磺酸钠(王忠永， 陶志华，杨建荣.RP-HPLC-E⑶检测血浆尿液中儿茶酚胺及其临床应用.宁夏医学杂志， 2003, 25(8) :466-468)。但是辛烷磺酸钠具有刺激性，皮肤接触其蒸气或溶液，可引起皮 炎；眼睛接触时，可造成眼角膜损伤，因此有必要降低其使用量，同时又不会影响检测结果 准确性。 再者，在利用HPLC-E⑶检测诸如血液和尿液之类的样品中的儿茶酚胺时，需要 对样品进行预处理。现有方法大多采用2~4ml血浆或尿液利用活性氧化铝吸附或活性氧 化铝微柱进行预处理，如王忠永、陶志华和杨建荣就分别选择2ml血浆和2ml尿液进行预 处理，预处理时使用30mg活性氧化铝吸附血浆和尿液中的儿茶酚胺，然后加入HC10 4溶液 将儿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于HPLC检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂，所述试剂包括流动相，用于样品预处理的活性氧化铝、0.2M HCl溶液和0.01M EDTA‑2Na溶液，其特征在于：每1000ml所述流动相中，无水乙酸钠 4.1g，EDTA‑2Na 0.05g，乙腈70～90ml，辛烷磺酸钠0.08～0.10g，冰醋酸7.5ml，其余为ddH2O， pH值4.0～4.3。

【技术特征摘要】
1. 一种用于HPLC检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂，所述试剂包括流动相，用于样品预 处理的活性氧化铝、0. 2M HC1溶液和0. 01M EDTA-2Na溶液，其特征在于： 每1000ml所述流动相中，无水乙酸钠4. lg，EDTA-2Na 0. 05g，乙腈70?90ml，辛烧磺 酸钠 0. 08?0. 10g，冰醋酸7. 5ml，其余为ddH20, pH值4. 0?4. 3。2. 如权利要求1所述的试剂，所述HPLC检测的条件为C18反相色谱柱，流速：0. 2ml/ min ;柱温：38°C ;参比电压ECDl=-100mV，工作电压ECD2=100mV，保护池电压Guard=350mV。3. 如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述样品选自血液或尿液，当所述样品为尿 液时，所述试剂还包括用于样品预处理的浓盐酸。4. 如权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述用于样品预处理的0. 01M EDTA-2Na溶 液与所述血液或尿液的体积比为1: 1〇〇。5. 如权利要求3所述的试剂，其特征在于，当所述血液用量为0. 5ml或所述尿液用量为 0. 2ml时，所述用于样品预处理的活性氧化铝用量为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：阳愿望，霍玉美，潘超，单洪波，
申请(专利权)人：广州艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44