含黑色素细胞的皮肤模型、其构建方法及用途技术

本发明专利技术涉及含黑色素细胞的皮肤模型、其构建方法及其用途。具体而言，本发明专利技术公开了一种皮肤模型，其包含表皮层和成纤维细胞层，其中所述表皮层包括角质层和含有黑色素细胞的基层，且所述基层与成纤维细胞层直接接触。此皮肤模型与人皮肤组织结构相似，在没有UV的条件下成纤维细胞与黑色素细胞之间相互作用及所产生的细胞因子调节黑色素细胞产生黑色素。本发明专利技术还公开了所述皮肤模型的制备方法，及其用于美白化妆品及退色素剂的功效鉴定及安全评价等应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织工程重组
，更具体地，涉及包含黑色素细胞的皮肤模型，所述皮肤模型的构建方法，及其用于美白化妆品安全和功效评价，或用于检测化学品对皮肤的刺激性和/或腐蚀性的应用。
技术介绍
皮肤是最大的人体器官。天然的皮肤有两个主要功能：防止干燥和抵御外界环境的伤害，例如细菌、化学物质和紫外线的伤害。人类皮肤由外向内大致可分为3层：表皮层、真皮层和皮下组织。表皮层包括角质层和基底层，其中，角质层是皮肤的最外层，能耐受一定的物理、化学、机械性伤害，对内部组织起保护作用。基底层是表皮层的最内层，由基底细胞和黑色素细胞构成。真皮层位于表皮深层，向下与皮下组织相连，与后者无明显界限。真皮层包含纤维、基质以及分散在基质中的细胞成分，如成纤维细胞。 药物、化妆品(包括美白化妆品)、农药、生物制品、洗涤剂及清洁剂等日用品是否引起机体皮肤刺激反应进行预测是安全性评价及危险鉴定的重要组成部分。传统常用的毒性试验是在动物如豚鼠或兔的体内进行。然而，动物实验本身存在许多问题，如试验评分主观性强、结果重复性差、动物和人之间的种属差异等，均影响这些待测样品对人体安全性的评价。同时，人类皮肤的特性在很大程度上限制了使用动物模型对新药物、消费产品与化妆品进行安全性试验。 1959年英国动物学家William Russell和微生物学家Rex Burch提出动物实验的减少(Reduction)、替代(Replacement)和优化(Refinement)的3R系统理论以来，在世界范围内已得到广大科技人员的认同。国外的3R研究发展迅速，动物保护意识和动物福利运动兴起，特别是近20多年来，不再以动物模式为基础的毒理学研究和评价方法已成为生物医学重要发展方向，并被政府和研究机构所接受。欧盟甚至制定法规来禁止销售采用动物做实验的产品和原料，这些推动着实验动物替代方法研究的快速发展。 欧盟化妆品规程第7次修正案(2003/15/EC，2003)中明确规定，自2009年3月起在欧盟范围内禁止使用动物进行化妆品毒性和过敏实验，2013年起禁止使用动物进行化妆品原料的安全性评价，逐步不允许成员国从外国进口和销售进行动物实验的化妆品，并列入进入世界贸易组织(WTO)所签订的双边协议的条款。动物实验替代方法在国际贸易中以技术壁垒的形式直接影响着经济发展。 因此，研究者已经努力开发构建出多种皮肤模型，用于替代动物模型而研究皮肤的生理学作用，并用于检测化妆品或药物制剂等在体内的反应。皮肤模型应具备屏障功能，对环境中的刺激和人类皮肤有同样的反应。 皮肤腐蚀试验替代方法的预验证研究开始于1994年，至2004年国际社会基本接受的皮肤腐蚀试验的替代方法主要有3项，分别是大鼠经皮电阻试验(TER)、Corrositex检测和人工皮肤模型试验(Episkin试验和EpiDerm试验)。EpiSkinTM检测方法因高灵敏度和特异性而成为体内皮肤刺激试验—Draize试验的替代方法。在2008年布鲁塞尔召开的科学会议上，科学家们综述并评估了大鼠经皮电阻试验(TER)和人类表皮模型，确定了这些模型可以安全地用于评估皮肤刺激性和腐蚀性。 目前为止已建立的皮肤模型主要有两种类型：一种为表皮模型，由生长在基质上的多层分化的人角质细胞构成；另一种为全皮模型，在含有人成纤维细胞的基质上培养人角质细胞，并多层分化。角质细胞必须经气-液界面培养后，角质细胞则发展成排列致密的角质层，能够模拟天然皮肤的屏障功能。 在欧美体外皮肤刺激试验验证方法中，三种商品化的再造人类皮肤模型被欧洲替代方法验证中心(ECVAM，European Centre for the Validation of Alternative Methods)所接受，批准用于验证试验。这些模型在某些方面(例如形态学、脂类组成和生化标记)显示出和天然人类皮肤的相似性，被证明是光毒性、腐蚀性、刺激性试验方面有用的工具。 除了化妆品的毒性检测外，这些人造表皮模型也被用在化学品的皮肤吸收、渗透和通透性检验。这些模型也可以用来评估外用制剂、药物、针对皮肤疾病的其他治疗方法以及保护皮肤抵抗紫外线侵害的材料。同样的技术也适用于烧伤、受伤及外科手术后覆盖并保护伤口的人工皮肤。 在国内的研究中，2001年伍津津申请了专利“复合人工皮肤的制备方法”(中国专利申请号：01107099.4)，该专利包括溶液的制备、I和III型人胶原基质凝胶的制备和成纤维细胞和表皮细胞呈三维方向生长的培养方法。但该专利没有对表皮细胞的来源及性质进行论述。 中国专利技术专利申请NO.03134535.2公开了覆盖生物支架材料及组织工程真皮的制备方法。但该方法制备的人工皮肤仅由胶质层和成纤维细胞层组成的真皮组织，不含角质细胞及其分化而形成的角质层。因此，与人体皮肤组织结构差异较大。这两个模型主要用于烧伤、创伤、溃疡等病人的临床治疗。 中国专利技术专利申请NO.200810029210.8涉及采用嵌入式培养法制备毒性检验用器官型人工皮肤的方法。 中国专利技术专利CN101352586B涉及利用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法，其中采用干细胞培养技术制备毒性检验用全层皮肤，包括高分子真皮支架制备与修饰、全层皮肤培养基的制备及全层皮肤的构建方法。该专利强调利用胚胎干细胞和皮肤组织来源的人表皮干细胞，进行构建人皮肤模型。 然而，尽管现有的皮肤模型在一定程度上模仿了人类皮肤的结构，但由于这些皮肤模型不含有黑色素细胞，因而并不适用于黄色、棕色及黑色人种皮肤的验证试验，也不适合用于评估临床药物和美白化妆品功效。 黄色、棕色及黑色人种的皮肤含有大量的黑色素细胞，能分泌大量的黑色素。人皮肤、头发和眼睛的颜色是由黑色素的量和其分布来决定的。在皮肤里，黑色素是由黑色素细胞中的黑色小体产生的。黑色素细胞本身不是黑色的，而是具有分泌黑色素颗粒的功能，能吸收阳光中的紫外线，阻止紫外线射入体内，避免深层组织受到伤害。在高强度紫外线下，黑色素母细胞会分泌黑色素，在细胞上形成吸收紫外线的黑色保护伞，保护细胞不被紫外线射伤。在紫外线的诱导下，许多从角质细胞和成纤维细胞分泌出来的因子，例如干细胞因子、肝细胞生长因子、干扰素-γ、内皮素-1、碱性成纤维细胞生长因子、白介素-1等。这些细胞因子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种皮肤模型，其包含表皮层和成纤维细胞层，其中所述表皮层包括角质层和含有黑色素细胞的基层，且所述基层与成纤维细胞层直接接触。

【技术特征摘要】
2013.02.08 CN 201310050686.01.一种皮肤模型，其包含表皮层和成纤维细胞层，其中所述表皮层包括角
质层和含有黑色素细胞的基层，且所述基层与成纤维细胞层直接接触。
2.如权利要求1所述的皮肤模型，其不包含胶原层或者所述表皮层还包括
棘层，所述棘层介于角质层与基层之间。
3.如权利要求1或2所述的皮肤模型，其中，所述成纤维细胞层由连续的
成纤维细胞组成。
4.如权利要求1-3中任一项所述的皮肤模型，其中，在所述表皮层中，黑
色素细胞与角质细胞的比例可以在1:50至50:1之间，优选黑色素细胞与角质细
胞的比例为1:10。
5.权利要求1-4中任一项所述皮肤模型的制备方法，所述方法包括以下步
骤：
1)在用胶原处理过的膜上或固化的胶原层上加入成纤维细胞悬液，并培养
产生成纤维细胞层；
2)在所述成纤维细胞层上方加...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜镇建，张兴民，张春晓，陈博，王智，
申请(专利权)人：北京富龙康泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11