基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法技术方案

本发明专利技术提供了一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法。该成骨细胞电刺激系统包括：微流控芯片，由透明材料制备，具有一用于承载细胞培养基，为成骨细胞的培养提供空间环境的微沟道，该微沟道的两端分别设置入口和出口；倒置显微镜，其镜头从微流控芯片的底部对准微沟道的中部；两弹性密封塞，分别塞住微沟道的入口和出口；以及电刺激信号源，用于提供电刺激信号，其两电极分别穿过两弹性密封塞后伸入微沟道内的细胞培养基液面下。本发明专利技术成骨细胞电刺激系统可以实现单个成骨细胞的分析，评估不同电势差对单个成骨细胞的影响效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞体外微环境重建
，尤其涉及一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法。
技术介绍
骨不愈合或延迟愈合是骨折后的严重并发症，骨形成障碍是其主要原因之一。骨形成是一个复杂现象，是指间充质成骨细胞祖细胞通过募集和复制，进一步分化为前成骨细胞及成熟成骨细胞，最终导致细胞外基质的积聚和矿化的过程。在此过程中成骨细胞起了关键作用，因此研究如何促进成骨细胞的增殖是十分重要的。近年来，很多学者证实多种刺激方法均可促进成骨细胞的增殖，如电、微波振动、冲击波、磁场作用等。其中，电刺激方法的刺激来源更容易得到，而且已经有许多实验结果证明电刺激可明显促进成骨细胞的增殖及分化，对促进骨愈合的研究有重要作用，因此成骨细胞的电刺激研究是十分必要的。明斯特大学的Wiesmann教授于2000年证实了电刺激能够促进成骨细胞的生物矿化过程(biomineralization process)。成骨细胞接受电刺激后，矿物质分泌过程明显加强。首尔大学的In Sook Kim等人于2005年研究调查两相电流刺激对鼠颅盖骨的成骨细胞增殖、分化、合成细胞因子的影响。在此研究中，给予成骨细胞1.5μA/cm2、3000Hz的电刺激。结果表明持续电刺激后成骨细胞增殖31％，而间断电刺激没有明显变化。实时监测RT-PCR和ELISA表明血管内皮生长因子(VEGF)于电刺激后明显上调。从而得出结论两相电流刺激可促进细胞增殖，诱导VEGF的产生。该项研究证实了电刺激的有效性。曼彻斯特大学的Griffin教授于2010年利用一种电刺激装置，采用不同的电信号对成骨细胞产生电刺激，证实了不同电信号对成骨细胞的增殖和矿化过程具有不同程度的促进作用。上述几个发现和结论均通过宏观实验获得，并不能准确评估电刺激对成骨细胞的影响效果，而且电刺激促进成骨细胞增殖的机制尚不完全明确，这也限制了对成骨细胞电刺激影响的进一步研究。微流控技术又称为“芯片实验室”，是在微观尺寸下控制和检测流体的技术。由于其具有通道尺寸与人体细胞大小相匹配，网络结构与生理状态下细胞的空间特征相接近以及多种单元灵活组合等优点已经广泛用于细胞生物学研究。通过微流控技术研究电成骨细胞更接近于生理状态，更有利于揭示电刺激对成骨细胞的影响及潜在机制。基于微流控技术的成骨细胞电刺激方法为体外生长的细胞提供更加贴近体内的局部微环境，为细胞生物学提供新的研究方法。东京大学的Kihoon Jang等人于2007年提出一种用于药物筛选的成骨细胞3D微流控芯片。该微流控芯片的微通道呈线形，长6cm，宽200μm，深100μm，每个通道的有效区为0.31cm2。通过此系统用很少量的细胞即获得了预期的实验结果。该研究说明了通过微流控技术研究成骨细胞的可行性。布朗大学的Ercan教授于2009年提出一种在微纳米管内实现成骨细胞电刺激的方法。该方法中，在微纳米管表面镀一层经过阳极化处理的金属钛，连接信号源后给予管内的成骨细胞电刺激。该研究可以说明在该条件下电刺激对成骨细胞行为的影响。尽管已经有不少学者通过微流控技术对成骨细胞实施刺激并观察细胞反应，但这些实验与方法均无法对单个成骨细胞进行分析，也无法准确评估不同电势差对单个成骨细胞的影响效果。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题鉴于上述技术问题，本专利技术提供了一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法。(二)技术方案本专利技术基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统包括：微流控芯片，由透明材料制备，具有一用于承载细胞培养基，为成骨细胞的培养提供空间环境的微沟道，该微沟道的两端分别设置入口和出口；倒置显微镜，其镜头从微流控芯片的底部对准微沟道的中部；两弹性密封塞，分别塞住微沟道的入口和出口；电刺激信号源，用于提供电刺激信号，其两电极分别穿过两弹性密封塞后伸入微沟道内的细胞培养基液面下。根据本专利技术的另一个方面，提供了一种上述成骨细胞电刺激系统的操作方法。该操作方法包括：步骤S102，对微流控芯片进行灭菌消毒；步骤S104，将经过灭菌的微流控芯片置于培养皿内，用移液枪将细胞培养基和成骨细胞分别注入微沟道；步骤S106，封堵微流控芯片上微沟道的入口和出口，为成骨细胞培养提供培养环境，将成骨细胞培养至贴壁；以及步骤S108，在微流体沟道入口及出口分别插入电极，确保连接紧密后，连接并打开电刺激信号源，给予相应电刺激。(三)有益效果从上述技术方案可以看出，本专利技术基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统具有以下有益效果：(1)可以实现单个成骨细胞的分析，评估不同电势差对单个成骨细胞的影响效果；(2)由于在细胞培养及观察过程中，入口及出口均保持密闭，可有效减少液面的波动，为成骨细胞的培养提供稳定的外部环境，从而消除细胞培养过程中流体应力对细胞产生的不利影响；(3)由于电刺激由信号源通过电极导线提供，可以根据需要提供不同电压、电流及不同类型的电刺激；(4)基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统样品消耗在微升量级，节约样品；(5)选取载玻片和聚二甲基硅氧烷(PDMS)等低成本材料进行加工，可以有效降低成本。附图说明图1为根据本专利技术实施例基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统的示意图；图2为图1所示成骨细胞电刺激系统中微流控芯片制备方法的流程图；图3A为图2所示制备方法中制备微流控芯片前期各步骤的示意图；图3B为图2所示制备方法中制备微流控芯片后期各步骤的示意图；图4为根据本专利技术实施例成骨细胞电刺激系统操作方法的流程图；图5A为利用图1所示成骨细胞电刺激系统进行细胞注入步骤时，细胞注入机制示意图；图5B为利用图1所示成骨细胞电刺激系统进行细胞培养步骤时，细胞培养机制示意图。【主要元件】1-电刺激信号源；   2-电极导线；3、4-弹性密封塞；  5-微沟道；6-电极；           7-载玻片；8-成骨细胞；       9-移液枪头；10-聚四氟乙烯管。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术进一步详细说明。需要说明的是，在附图或说明书描述中，相似或相同的部分都使用相同的图号。附图中未绘示或描述的实现方式，为所属
中普通技术人员所知的形式。另外，虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，包括：微流控芯片，由透明材料制备，具有一用于承载细胞培养基，为成骨细胞的培养提供空间环境的微沟道，该微沟道的两端分别设置入口和出口；倒置显微镜，其镜头从微流控芯片的底部对准所述微沟道的中部；两弹性密封塞，分别塞住所述微沟道的入口和出口；以及电刺激信号源，用于提供电刺激信号，其两电极分别穿过所述两弹性密封塞伸入所述微沟道内的细胞培养基液面下。

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，包括：
微流控芯片，由透明材料制备，具有一用于承载细胞培养基，为成骨
细胞的培养提供空间环境的微沟道，该微沟道的两端分别设置入口和出口；
倒置显微镜，其镜头从微流控芯片的底部对准所述微沟道的中部；
两弹性密封塞，分别塞住所述微沟道的入口和出口；以及
电刺激信号源，用于提供电刺激信号，其两电极分别穿过所述两弹性
密封塞伸入所述微沟道内的细胞培养基液面下。
2.根据权利要求1所述的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，所述
微流道的横截面形状为矩形、圆形或椭圆形。
3.根据权利要求2所述的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，所述
微沟道的横截面形状为矩形，其长度为13mm、宽度为800μm、高度为
100μm。
4.根据权利要求1所述的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，所述
微流控芯片包括：
其下方具有微槽道的有机聚合物盖片；以及
位于该有机聚合物盖片下方的载玻片，其中，该微槽道与位于其下方
的载玻片部分构成上述微沟道。
5.根据权利要求4所述的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，所述
有机聚合物盖片由以下材料其中之一制备：聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯
酸甲酯和聚碳酸酯。
6.根据权利要求5所述的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，所述
微流控芯片采用以下工艺制备：
步骤A，制作微流控芯片主模，包括：
子步骤A1，清洗并烘干载玻片；
子步骤A2，在载玻片表面均匀旋转涂敷SU-85光刻胶，前烘、曝
光及后烘；
子步骤A3，在载玻片表面继续旋转涂敷SU-82100光刻胶，前烘、
曝光及后烘；以及
子步骤A4，使用SU-8显影液对载玻片作显影处理，显影完成后将
载玻片置于热板上竖膜，得到微流控芯片主模；
步骤B，利用微流控芯片主模采用模塑法制作具有微沟道的有机聚合
物盖片，包括：
子步骤B1，对微流控芯片主...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈健，祁宝昌，卫超，赵阳，卫元晨，陈德勇，王军波，
申请(专利权)人：中国科学院电子学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11