本发明专利技术公开了一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：将木兰假丝酵母（CandidamagnoliaeCGMCC2.1919）或酿酒酵母（SaccharomycescerevisiaeCGMCC2.399）在121℃灭菌20min的PYG培养基平板上划线，于25-30℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面静置培养，生长2天后于4℃保存备用；常规细胞培养：常规生物转化。本发明专利技术获得的产品光学纯度高、成本低且安全环保。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生化
，具体来说涉及一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法。
技术介绍
Y-羟基酸酯是一类重要的化工医药中间体以及很多重要生物活性化合物的重要结构单元，其手性单一对映异构体0 )和C )-Y_羟基酸酯均是重要的手性砌块，4-羟基-4-苯基丁酸酯及其衍生物是合成手性内酯或者其他一些化工医药类化合物的重要结构单元。 目前所知的制备手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的方法，通常采用的是化学催化剂和酶催化酮酸酯的不对称还原法。化学方法主要采用金属催化剂，金属催化剂价昂贵，对环境污染大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述缺点而提供一种能获得光学纯度高、成本低且安全环保的手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法。本专利技术的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤 (I)菌株的准备将菌株在121 °C灭菌20 min的PYG培养基平板上划线，于25-30 V静置培养I天后挑取单菌落，作为种子进行斜面静置培养，生长2天后于4 1保存备用； (2)细胞的培养挑取上述斜面培养的种子，接种到含有10mL PYG培养基的50 mL的摇瓶中，在30 1和200 rpm的转速下进行培养24h后，按5%的接种量接种于含有100 mLPYG培养基的500 mL的大摇瓶中，在摇床上培养24h后取出，在4 1和8000 rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4 1下用生理盐水洗涤二次，离心，获得菌株的湿细胞备用； (3)生物转化将所培养的菌株的湿细胞，以细胞湿重10g /L的浓度悬浮于100 mL、pH为6-8的缓冲液中，将底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反应体系之中，再加入有机溶剂5 mL，葡萄糖250 mg，放入摇床反应(30 °C, 300 rpm)，HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得手性4-羟基-4-苯基丁酸酯。上述的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，其中菌种为木兰假丝酵母{Candida magnoliae CGMCC 2. 1919)或酿酒酵母(feccAaro焊ces cerevisiae CGMCC2.399)，既可以采用休止细胞，生长中的细胞，也可以是固定化的细胞，或者使用其所含的还原酶。上述的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，其中PYG培养基的配方为蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,琼脂15. O g,蒸馏水I. O L，pH6.8_7· O ο上述的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，其中缓冲液为K2HPO4-KH2PO4 或 NaH2PO4-Na2HPO4 缓冲液。上述的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，其中有机溶剂为甲醇、乙醇、正己烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、甲苯或甲基叔丁基醚等。本专利技术与现有技术相比，具有以下明显的优点和有益的效果，从以上技术方案可知在生物催化反应中，有机溶剂的影响，涉及到溶剂对酶的抑制作用，对活性中心的修饰作用以及底物的溶解性、分散度等等诸多因素。水相反应中加入少量的有机溶剂有时也会对反应有明显的影响，经实验证实加入了所选的有机溶剂，反应的转化率有所提高，而对映选择性则基本上没有什么改变。实验证明，magnoliae CGMCC 2. 1919和Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2. 399两株酵母细胞内含有高立体选择性的还原酶,能有效的催化4-氧代-4-苯基丁酸乙酯的不对称还原反应，合成手性4-羟基-4-苯基丁酸 酯。由于4-氧代-4-苯基丁酸酯易于合成且价格便宜，以其作为底物进行不对称氧化反应获取手性4-羟基-4-苯基丁酸酯是非常经济有效的制备途径。本专利技术的具体实施方式来进一步说明本专利技术的有益效果。具体实施例方式实施例I 一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤 (1)菌株的准备将木兰假丝酵母magnoliaeCGMCC 2. 1919)(购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)在121 °C灭菌20 min的PYG培养基(蛋白胨10. O g，酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,琼脂15. O g,蒸懼水I. O I, pH 6. 8-7. O)平板上划线，于25 1静置培养I天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养，约2天后保存于4 °C冰箱中备用; (2)细胞的培养挑取上述斜面培养的种子，接种到10mL PYG培养基(蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,蒸懼水I. O L, pH 6. 8-7. O)的50 mL的摇瓶中，在30°〇和200 rpm的转速下进行培养24h后，按5%的接种量接种于含有100 mL生长培养基的500 mL的大摇瓶中，在摇床上培养24 h后取出，在4 1和8000 rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4 1下用生理盐水洗涤二次，离心，得木兰假丝酵母湿细胞(细胞内含有R-选择性的羰基还原酶)备用； (3)生物转化取木兰假丝酵母湿细胞5g，悬浮于50 mL pH 7. O的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，将底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反应体系之中，加入乙醇5 mL，葡萄糖250 mg，放入摇床反应(30 0C, 300 rpm)，HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，得到0 )-4_羟基-4-苯基丁酸乙酯。42%产率，产物做手性GC分析，99% ee。产物分析4-羟基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR和13C NMR如下=1H NMR (300MHz, CDCl3) : δ 7. 22 (d, 2H, Ph)，7. 16 (d, 2H, Ph)，4. 68 (pt. 1H, CH0H)，2. 40 (q2H, CH2), 2. 34 (s, 3H, CH3), 2. 23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), I. 25 (q, 3H,CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173，145，128，126，74，61，34，30，14. 实施例2 一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤(I)菌株的准备将酿酒酵母cerevisiae CGMCC 2. 399)(购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)在121 °C灭菌20 min的PYG培养基(蛋白胨10. Og,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,琼脂15. O g,蒸馏水I. O L，pH 6. 8-7. O)平板上划线，于30 1静置培养I天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养，约2天后保存于4 V冰箱中备用； (2)细胞的培养挑取上述斜面培养的种子，接种到10mL PYG培养基(蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,蒸懼水I. O L, pH 6. 8-7. O)的50 mL的摇瓶中，在30 °〇和2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种手性4？羟基？4？苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：？（1）菌株的准备：将菌株在121？℃灭菌20？min的PYG培养基平板上划线，于25？30？℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面静置培养，生长2天后于4？℃保存备用；（2）细胞的培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到含有10？mL？PYG培养基的50？mL的摇瓶中，在30？℃和200？rpm的转速下进行培养24h后，按5%的接种量接种于含有100？mL？PYG培养基的500？mL的大摇瓶中，在摇床上培养24h后取出，在4？℃和8000？rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4？℃下用生理盐水洗涤二次，离心，获得菌株的湿细胞备用；（3）生物转化：将所培养的菌株的湿细胞，以细胞湿重10？g？/L的浓度悬浮于100？mL、？pH为6？8的缓冲液中，将底物4？氧代？4？苯基丁酸乙酯50？mg加入到反应体系之中，再加入有机溶剂5？mL，葡萄糖250？mg，放入摇床反应（30？℃，300？rpm），HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得手性4？羟基？4？苯基丁酸酯。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈永正，卓俊睿，郑代军，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：
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