本发明专利技术“黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记及其应用”，涉及生物育种辅助技术。标记序列如下：SSR21558-F/SSR21558-R:GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAAC，其扩增的特征条带如Seq?ID?No.1所示（175bp）和Seq?ID?No.2所示（192bp）。SSR20054-F/SSR20054-R：GTTTGTGAGGGAAACGCAAT/TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA，其扩增的特征条带如Seq?ID?No.3所示（127bp）和Seq?ID?No.4所示（108bp）。本发明专利技术的两个标记与Bt基因的连锁更加紧密，对于黄瓜果实苦味的分子标记辅助育种体系的建立更有帮助；采用本发明专利技术获得的SSR标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果实苦味或果实无苦味的筛选，具有高效、限制少、准确的优点，为黄瓜育种选择无苦味材料提高了选择效率和准确性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物育种辅助技术，特别是ー种黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记及其应用。
技术介绍
黄瓜(Cucumis sativus L.)生产中,特别是设施栽培过程中,有时会有苦味果实产生，导致收益损失(Rehm et al.，1957 ;顾兴芳等，2000 ;Kano et al.，2002)。瓜类植物的苦味是由一类称为葫芦素(Cucurbitacins)的物质引起(Rice et al. , 1981 ；Balkema etal.，2003)。葫芦素属于葫芦烷型四环三萜化合物，对大多数生物体有毒(Smyth et al.，2002)。果实苦味是影响黄瓜生产的问题之一。荷兰黄瓜育种家早在1959已经开始无苦味黄瓜的选育工作，并育成相应的品种，这些品种的营养器官和果实均无苦味(AndeweG andBruyn, 1959)。研究导致黄瓜果实苦味发生的基因的分子标记和遗传定位，对于利用分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection, MAS)技术培育无苦味黄瓜具有重要意义。已报道的控制黄瓜果实苦味的两个基因是Bt和Bt-2 (Barham, 1953 ；ffalters,2001)。本实验室保存的黄瓜材料PI183967 (基因型为BiBiBtBt)含有Bt基因。前人关于黄瓜果实苦味的研究多集中于遗传规律、基因连锁、环境影响、品种选育等方面。已有研究表明，Bt和Bt-2基因均符合单基因显性遗传，符合质量性状遗传的特点(Barham，1953 ；InGGamer and Deponti, 1981 ;Walters et al.,2001)。Bt 基因与黄瓜雌性基因 F 不存在连锁(Cowen and Helsel，1983 ;顾兴芳等，2005)。Bt_2基因与果色一致基因U、暗色果皮基因D、小刺基因ss连锁(Wehner and Liu, 1998 ；ffalters et al.，2001)。栽培条件影响黄瓜苦味的发生(Kano et al.，2003)，当土壌中的氮素过多或不足、有机肥缺乏、温度过低或过高、日光照射不足、营养不良、上壤干旱缺水、病虫害以及植株衰弱多病等条件下，都可诱发葫芦素的形成和积累，从而形成苦味果实。对于黄瓜果实苦味决定基因Bt分子水平的研究主要是由本实验室开展进行的。我们从分子水平对果实苦味基因进行了研究并获得了与Bt基因连锁的两个显性AFLP标记E23M66-101和E25M65-213。这两个标记与Bt基因的遗传距离分别为5cM和4cM，并且位于Bt基因的两侧(顾兴芳等，2006)。2011年以果实无苦味的黄瓜纯合自交系新泰密刺(btbt)和果实有苦味46GBt (BtBt)为亲本构建的含有184个单株的F2群体为试材，对其进行SSR标记遗传连锁分析，构建了 Bt基因的SSR连锁群。与Bt基因最近的两侧标记为SSR10795和SSR07081，遗传距离分别为O. 8cM和2. 5cM (张圣平等，2011)。但是上述标记还存在连锁距离相对较远，且标记的检测准确率相对较低的问题，在进行无苦味黄瓜育种筛选中的选择效率相对较低。黄瓜果实苦味的遗传比较复杂，受到营养体苦味基因Bi的影响，隐性bi基因与Bt基因存在互作效应(Gu et al.，2007)。但在纯合Bi基因背景下，Bt基因是独立遗传的(Barham, 1953 ；ffalters and Wehner, 1998 ；Gu et al.，2007)。为了排除黄瓜营养体苦味基因对果实苦味基因的互作影响，本专利技术中利用营养体苦味基因纯合的基因型，进行了果实苦味Bt基因的SSR分子标记及遗传定位研究。目前检测黄瓜苦味的方法多为感观品尝和化学检测，化学检测虽可检测大批材料但较为繁琐，其结果也不够准确；感观品尝仅适于少量材料的检测，并且无法进行精确定级(顾兴芳等，2004)，所以急需建立ー套快速准确鉴定苦味的方法，为培育无苦味黄瓜提供理论依据。分子标记辅助选择(MAS)技木通过找到与苦味基因紧密连锁的分子标记可在苗期或直接用种子进行鉴定，简エ节本，大大缩短育种进程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术不足，提供了与黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记，并提供了其在选择无苦味黄瓜种质资源上的应用，采用本专利技术获得的SSR标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果实苦味或果实无苦味的筛选，具有高效、限制少、准确的优点，为黄瓜育种选择无苦味材料提高了选择效率和准确性。 黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记，序列如下SSR2I558-F/SSR2I558-R:GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAAC (SeqID No. 5和SEQ ID No. 6)，其扩增的特征条带如Seq ID No. I和Seq ID No. 2所示。其中Seq ID No. I所示175个核苷酸的片段与果实苦味基因Bt连锁，Seq ID No. 2所示192个核苷酸的片段与果实不苦基因bt连锁。SSR20054-F/SSR20054-R:GTTTGTGAGGGAAACGCAAT/TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA (SeqID No. 7和SEQ ID No. 8)，其扩增的特征条带如Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示。其中Seq ID No. 3所示的127个核苷酸的片段与果实苦味基因Bt连锁，Seq ID No. 4所示108个核苷酸的片段与果实不苦基因bt连锁； 上述SSR标记在筛选含有无果实苦味基因Bt的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下(I)采用上述SSR标记为引物对黄瓜品种待选材料的基因组DNA分别进行PCR扩士豳>曰，(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测，(3)从凝胶电泳检测的结果中选出没有出现所述果实苦味特征条带的材料。所述PCR扩增的体系Green Master Mix 5 μ L, 15ng DNA,正向、反向引物各30nG，其余以ddH20补足至IOyL;PCR扩增的程序为94°C预变性4min ;94°C变性15s ;55°C退火15s ;72°C延伸30s 35个循环；72°C保温5min。所述凝胶电泳检测指采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于160V恒功率电泳分离，最后银染显色。本专利技术以果实有苦味的野生黄瓜PI183967 (Cucumis sativus var. hardwickii)和果实无苦味的黄瓜931纯合新泰密刺选系(btbt)为亲本构建的含有189个单株的F2群体为试材，对其进行SSR标记遗传连锁分析(图1，2)，构建Bt基因的SSR连锁群(图3)。该连锁群中与Bt基因最近的两侧的连锁标记之ー为SSR21558，遗传距离为O. 5cM ;另ー标记SSR20054，遗传距离为I. OcM0经不同遗传背景材料验证，标记SSR21558检测结果与田间表现型相比验证的准确率为为95%，SSR20054标记的准确率为75%，使用两标记相互印证进行验证的准确率可达95%。与Bt基因紧密连锁的标记SSR21558和SSR20054可用于对黄瓜品种候选材料快速筛选，特别是可以对黄瓜苗期的材料或种子直接进行分子鉴定本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记，序列如下SSR21558-F/SSR21558-R: GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAAC，其扩增的特征条带如 Seq ID No. I 所示和Seq ID No. 2所示， SSR20054-F/SSR20054-R:GTTTGTGAGGGAAACGCAAT/TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA，其扩增的特征条带如Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示。2.权利要求I所述的SSR标记在选择无果实苦味基因Bt的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下 (1)采用所述SSR标记为引物对黄瓜待选材料的基因组DNA分...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾兴芳，张圣平，苗晗，王烨，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。