本发明专利技术属于分子生物学和免疫学领域，涉及赖氨酸脱羧酶抗原表位、抗赖氨酸脱羧酶抗体及其用途。具体地，所述赖氨酸脱羧酶抗原表位具有SEQ?ID?NO：3或SEQ?ID?NO：4或SEQ?ID?NO：5所示的序列。本发明专利技术还涉及一种抗赖氨酸脱羧酶多克隆抗体，所述多克隆抗体与上述抗原表位特异性结合。所述多克隆抗体具有高的特异性和效价。本发明专利技术还涉及所述多克隆抗体的制备方法和用途、含有该多克隆抗体的组合物、以及检测赖氨酸脱羧酶的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和免疫学领域。具体地，涉及一种赖氨酸脱羧酶抗原表位、 抗赖氨酸脱羧酶抗体。本专利技术还涉及分别含有所述抗原表位或抗体的组合物、以及所述抗体在检测赖氨酸脱羧酶中的用途。
技术介绍
赖氨酸脱羧酶(英文名称为lysine decarboxylase,酶分类号EC :EC4. 1. 1. 18)， 据cDNA序列推译的水稻赖氨酸脱羧酶蛋白(putative lysine decarboxylase-like protein, Pldclp)基因位于水稻基因组的第4条染色体上，由0s04g0518800基因编码，其 cDNA全长为1109bp，其中参与编码赖氨酸脱羧酶氨基酸的碱基有750bp，编码250个氨基酸残基，分子量为27493. 85Da。赖氨酸脱羧酶家族具有保守结构域PGGxGTxxE。Sioshi Kikuchi等(Science 301,376(2003))最早克隆测序了籼稻日本种群的cDNA，在据cDNA推译的氨基酸序列中发现有赖氨酸脱羧酶家族的保守结构域，从而推测此基因可能是赖氨酸脱羧酶家族成员之一。水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，也是植物生长发育、逆境反应等基础研究的模式植物，因为相对于其它禾本科植物，它的基因组相对较小 (430Mb)。水稻基因组测序成果极大地推动了水稻相关研究的进展，带动了水稻转录组学的研究，也推动了蛋白质组学的研究，利用2DE-MASS技术对水稻发育、逆境、愈伤组织分化等进行蛋白质组学分析，鉴定了一系列的差异表达蛋白质，同时，随着水稻功能基因组学工作的开展，对水稻蛋白质功能的验证和比较研究也日益增加，蛋白质印迹(Western blotting,WB)技术因具有灵敏度高、特异性好、操作简便、结果直观等优点而被广泛应用于检测水稻蛋白质在不同组织中的表达水平。随着水稻基因组计划的完成，蛋白质研究已成为后基因组研究的重要任务。抗体是研究蛋白质必不可少的工具之一，在一种新的cDNA被克隆以后，由此推译出的氨基酸序列人工合成多肽并与载体偶联，免疫制备其抗体，是一种快速而有效的手段。水稻赖氨酸脱羧酶蛋白主要定位于质膜上，在植物的耐寒、解毒等抗逆生理中发挥作用。赖氨酸脱羧酶的主要生物学功能是催化L-赖氨酸脱羧生成尸胺(1，5_戊二胺)， 尸胺有刺激性气味，它是生物体内广泛存在的具有生理活性的含氮碱，在腐烂的尸体和精液中都可分离得到。尸胺可以作为第二信使调控植物衰老进程、促进雌雄蕊的发育，外源施用尸胺可以改善坐果和促进果实发育，在增加果实产量和研究植物生长中有重要利用价值。赖氨酸脱羧酶在大肠杆菌中有大量的研究，并且在大肠杆菌体内发现多种赖氨酸脱羧酶，但在水稻中的作用研究较少，在水稻中的具体生理功能还不清楚。然而，迄今为止，水稻赖氨酸脱羧酶仍属于高度有待鉴定的蛋白，该蛋白在转录水平上的活动是其存在的证据。并且在现有技术中，通常制备的多克隆抗体特异性不高，用于检测目标物质会存在准确性不足的问题。另一方面，如果用赖氨酸脱羧酶制备抗原的话，如果是用化学合成的方法，全长的氨基酸序列有1996个氨基酸，蛋白质空间结构的重建是一个很困难的工作，再现与生物体内相同的空间构象仍然是现阶段蛋白质学研究的难点。一般来说抗原表位合成简易，准确性高，成本低廉，空间构象容易再现，因此有必要开发一种具有代表赖氨酸脱羧酶本身的抗原表位(antigenic determinant, AD)(又称抗原决定簇， 是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团)来代替全长蛋白。尽管目前已经有用于预测抗原表位的软件，例如ΒΕΡΙΤ0ΡΕ软件，但是预测得到的抗原表位中会有30%左右的非有效抗原表位，即不能特异性地代表抗原的抗原表位， 或者不能引发免疫应答(Chang HT, Liu CH, Pai Tff. Estimation and extraction of B-cell linear epitopes predicted by mathematical morphology approaches. J Mol Recognit. 2008 Nov-Dec ；21 (6) :431-41)。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术人在通过BEPIT0PE软件预测得到多个抗原表位序列的基础上，进行了大量的实验和不懈的努力，结果发现在预测的M个抗原表位中有一个抗原表位序列SSQGKKKSYQDAA(SEQID NO 3)是最有效的抗原表位，并且其具有良好的抗原特异性，并且制备了能与该蛋白酶特异免疫结合的抗体，该抗体具有足够的灵敏性和准确性。 由此提供了下述专利技术本专利技术的一个方面涉及一种赖氨酸脱羧酶抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。在本专利技术的一个实施方案中，为了增加与载体的交联性，在上述抗原表位的C末端添加了一个半胱氨酸(半胱氨酸提供二硫键与载体交联)，得到序列为 SSQGKKKSYQDAAC(SEQ ID NO 4)的抗原表位。半胱氨酸也可以加在多肽的N末端，得到序列为CSSQGKKKSYQDAA(SEQ ID NO 5) 的抗原表位。末端加1个半胱氨酸就可以了。如果在同一端加多个半胱氨酸，导致成本上升，并且二硫键密度太大，而实际上也不需要这么多二硫键。另外不宜在N末端和C末端都加半胱氨酸，因为一个抗原表位和一个载体结合，如果在两端分别加1个半胱氨酸，半胱氨酸与载体结合后，抗原表位少了游离端，反而不利于产生抗体。本专利技术的抗原表位可以通过常规的肽合成技术化学合成得到，也可以在适当的宿主中表达得到；优选的是化学合成。本专利技术的还一方面涉及一种组合物，其包含SEQ ID NO :3或SEQID NO :4或SEQ ID NO :5所示的赖氨酸脱羧酶抗原表位，任选地，可以含有免疫佐剂，例如氢氧化铝、弗氏完全佐剂、或者弗氏不完全佐剂等。本专利技术的还一方面涉及一种赖氨酸脱羧酶抗原表位-载体复合物；其中，所述赖氨酸脱羧酶抗原表位为SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示的赖氨酸脱羧酶抗原表位，所述载体可以是钥孔戚血蓝素(KLH)、BSA、或酪蛋白等。本专利技术的还一方面涉及一种抗赖氨酸脱羧酶抗体，所述抗赖氨酸脱羧酶抗体能够特异性地结合SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或SEQID NO :5所示的赖氨酸脱羧酶抗原表位。 所述抗赖氨酸脱羧酶抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。本专利技术的抗赖氨酸脱羧酶多克隆抗体可以得自各种常规制备多克隆抗体的动物，例如山羊，兔子，大鼠，小鼠等。对本领域技术人员而言，可以根据SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4或SEQ ID NO: 5所示的赖氨酸脱羧酶抗原表位制备单克隆抗体，具体操作可以参见本领域的技术手册，也可以参考文献例如 Nature 1975Kohler & Milstein Vol256，p495。本专利技术的还一方面涉及一种含有抗赖氨酸脱羧酶多克隆抗体的血清(简称多抗血清)，其通过使用SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5所示的抗原表位免疫动物制得。本专利技术的还一方面涉及一种抗赖氨酸脱羧酶多克隆抗体制备方法，包括将SEQ I本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种赖氨酸脱羧酶抗原表位，其由ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５所示的氨基酸序列组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴琳，刘佳，曾海攀，张军，王银竹，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：94
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