【技术实现步骤摘要】
一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法及试剂盒
本专利技术涉及一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法及试剂盒,属于分子检测
技术介绍
同源重组(HomologousRecombination)是指发生在非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组可以使受损的染色体通过与另一条未受损染色体的相同DNA进行自身的修复,这种修复保证了基因组的完整性。当细胞出现同源重组基因突变,导致同源重组缺陷(homologousrecombinationdeficiency,HRD)时,细胞不能通过同源重组的方式对DNA进行自身修复。比如我们熟知的乳腺癌肿瘤相关基因BRCA1和BRCA2就是同源重组蛋白。当个体的BRCA1和BRCA2两基因发生突变时,其乳腺癌终生风险为87%,患卵巢癌的风险也超过40%,而且会导致发病年龄提前。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PolyADP-ribosePolymerase,PARP)是一种DNA修复酶,在DNA修复通路中起关键作用。DNA损伤断裂时会激活PARP,它作为DNA损伤的一种分子感受器,具有识别、结合到DNA断裂位置的功能,进而激活、催化受体蛋白的聚ADP核糖基化作用,参与DNA的修复过程。因此,PARP抑制剂是一种靶向聚ADP核糖聚合酶的癌症疗法,它能将导致同源重组修复功能缺陷的肿瘤细胞发生合成致死,但不影响正常细胞,由此产生高选择性抗肿瘤作用。研究发现携带BRCA突变的肿瘤细胞对PARP抑制剂的敏感度 ...
【技术保护点】
1.一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法,其特征在于,其包括如下步骤:/nA)将FFPE DNA和BC DNA浓度稀释至6ng/μL,使用Covaris M220打断仪对片段进行处理得到片段化DNA;/nB)将片段化DNA加入到末端修复加A反应体系进行第一轮PCR反应,得到末端加A的片段化DNA;向反应完毕的PCR反应体系中加入配置好的连接体系进行第二轮PCR反应,反应完毕后使用磁珠纯化得到纯化后的连接产物;/nC)向纯化后的连接产物加入配置好的扩增体系,按照98℃45sec,1循环;98℃15sec,60℃30sec,72℃30sec,N循环,72℃1min,1循环的反应程序进行PCR反应,8℃下终止反应,使用磁珠纯化后得到DNA文库;使用Qubit定量使得FFPE DNA文库≥350ng,BC DNA文库≥200ng,并用2100生物分析仪对文库分析,主峰应位于150~500bp之间;/nD)杂交捕获:将FFPE DNA文库和BC DNA文库按照质量比1:1进行混合,向混合后的DNA文库加入人类Cot DNA和封阻序列,使用真空离心浓缩仪将DNA文库蒸干;/nE)向蒸 ...
【技术特征摘要】
1.一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法,其特征在于,其包括如下步骤:
A)将FFPEDNA和BCDNA浓度稀释至6ng/μL,使用CovarisM220打断仪对片段进行处理得到片段化DNA;
B)将片段化DNA加入到末端修复加A反应体系进行第一轮PCR反应,得到末端加A的片段化DNA;向反应完毕的PCR反应体系中加入配置好的连接体系进行第二轮PCR反应,反应完毕后使用磁珠纯化得到纯化后的连接产物;
C)向纯化后的连接产物加入配置好的扩增体系,按照98℃45sec,1循环;98℃15sec,60℃30sec,72℃30sec,N循环,72℃1min,1循环的反应程序进行PCR反应,8℃下终止反应,使用磁珠纯化后得到DNA文库;使用Qubit定量使得FFPEDNA文库≥350ng,BCDNA文库≥200ng,并用2100生物分析仪对文库分析,主峰应位于150~500bp之间;
D)杂交捕获:将FFPEDNA文库和BCDNA文库按照质量比1:1进行混合,向混合后的DNA文库加入人类CotDNA和封阻序列,使用真空离心浓缩仪将DNA文库蒸干;
E)向蒸干后的DNA文库加入DNA杂交体系,震荡混匀离心后室温孵育,按照95℃30s,65℃4h的杂交反应条件进行杂交,即可得到捕获后的文库;
F)捕获后文库扩增:向捕获后的文库中加入文库扩增反应体系,按照98℃45sec,1循环;98℃15sec,60℃30sec,72℃30sec,14循环,72℃1min,1循环的反应程序进行PCR反应得到扩增产物;使用磁珠纯化扩增产物;
G)文库测序:按照FFPEDNA文库和BCDNA文库以6:1比例进行混合,测试试剂对应位置,用Illumina公司生产的基因测序仪NextSeqCN500上机测序;使用软件对数据进行处理,去掉接头、引物以及低质量的序列;使用二代测序数据比对软件bwa将预处理所得gene-panel的原始数据比对到人类参考基因组上,得到每条序列的位置信息以及比对质量信息,然后使用软件(如Picard)对比对得到的结果进行质量评估。
2.根据权利要求1所述的基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法,其特征在于,末端修复加A反应步骤中第一轮PCR反应中,反应体系中包括末端修复酶2μL,末端修复缓冲液10μL,无核酸酶水48μL,反应条件为20℃,30min;65℃,30min;4℃终止反应;第二轮PCR反应的反应体系包含DNA连接缓冲液30μL,DNA连接酶3μL,连接增强子0.5μL,接头2.5μL,无核酸酶水14μL;反应条件为20℃,15min,4℃终止反应。
3.根据权利要求1所述的基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法,其特征在于,所述步骤C)中纯化后的连接产物为FFPEDNA时,N为8;纯化后的连接产物为BCDNA时,N为6;步骤C)中所述的扩增体系中包括纯化后的连接产物20μL,高保真热启动酶混合液25μL,文库扩增引物5μL。
4.根据权利要求1所述的基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法,其特征在于,所述的DNA杂交体系包括杂交缓冲液2.7μL,杂交缓冲液增强子8.5μL,DNA捕获探针4.5μL,无核酸酶水1.3μL。
5.根据权利要求1所述的基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法,其特征在于,所述的文库扩增反应体系中包括高保真热启动酶混合液25μL、文库扩增引物5μL和上一步洗脱的DNA20μ...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘异倩,闫慧婷,吕红,刘小莉,陈敏俊,陈维之,郑杉,何骥,杜波,
申请(专利权)人:臻悦生物科技江苏有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。