鸭λ干扰素突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了鸭λ干扰素突变体及其制备方法和应用。本发明专利技术首先确定以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为鸭λ干扰素原始氨基酸序列并对鸭λ干扰素所有氨基酸序列进行比对得到SEQ ID No.3所示的鸭λ干扰素保守序列，对其编码基因进行密码子优化得到SEQ ID No.5所示的优化基因。本发明专利技术还对该保守序列进行氨基酸单位点或多位点突变获得多个抗病毒活性提高的鸭λ干扰素突变体。本发明专利技术更进一步利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达所述的鸭λ干扰素或其突变体，所得到的突变体的抗病毒活性大幅提高，能够用于预防或治疗鸭病毒性疾病,对鸭养殖业中具有重大威胁的病毒性传染病具有显著的防御和抑制作用。

Duck interferon-lambda mutant and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
鸭λ干扰素突变体及其制备方法和应用
本专利技术涉及家禽干扰素及其突变体，尤其涉及鸭λ干扰素及其突变体，本专利技术还涉及利用家蚕杆状病毒表达系统制备所述鸭λ干扰素突变体的方法以及应用所述鸭λ干扰素突变体预防或治疗鸭病毒性疾病，属于鸭λ干扰素突变体的制备及应用领域。
技术介绍
干扰素是一种具有广谱抗病毒、抗寄生于细胞内细菌、抗肿瘤、调节免疫功能等广泛生物活性的细胞因子。IFN蛋白家族根据其编码基因的序列、染色体定位和受体特异性分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干扰素。Ⅰ型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-δ、IFN-ε、IFN-ζ、IFN-τ等，哺乳动物中主要是IFN-α和IFN-β。其中IFN-α有23种以上亚型，各个亚型具有相似的结构特点，分子量在19-26KDa之间，含有两个二硫键，与IFNAR1和IFNAR2受体系统结合。Ⅰ型干扰素具有较强的抗病毒活性，主要通过干扰病毒的复制抑制其增殖，还具有抗肿瘤和免疫调节的功能。Ⅱ型干扰素只有IFN-γ一个成员，又称为免疫干扰素，分子量在20-25KDa之间，没有二硫键，单体时没有活性，活化形式为二聚体或四聚体，其受体为IFNGR1和IFNGR2。主要作用是激活巨噬细胞杀灭微生物。Ⅲ型干扰素是新发现的细胞因子，包括λ1(IL-29)、λ2(IL-28a)、λ3(IL-28b)和λ4，特异性结合受体为IFNLR，包括两个亚基IFNLR1(IL28RA)和IL10RB，其中IL10RB是普遍表达的，而IFNLR1主要在上皮细胞、肝细胞和某些免疫细胞中表达，所以这些细胞可以对Ⅲ型干扰素作出反应。Ⅲ型干扰素与Ⅰ型干扰素关系密切，但有特殊的生理学功能，如刺激主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)分子的活化和表达，调节先天免疫和获得性免疫等。由于干扰素具有广谱抗病毒、抗肿瘤的活性以及强大的免疫调节作用，现已成为病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点之一。干扰素首先在禽类中发现，但与人及其他哺乳动物相比，鸭干扰素分子水平的研究起步较晚，与鸡相比，鸭干扰素方面的研究也相对较少。近年来，家禽病毒感染引起的流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、传染性法氏囊病、鸭瘟、鸭肝炎和马立克等传染性疾病愈演愈烈，每年都会给养禽业带来巨大的经济损失，严重制约了养禽业的健康发展，而如何有效的预防和治疗家禽的病毒性传染病一直是禽病防治和治疗研究中的重点。鸭干扰素对鸭养殖业中具有重大威胁的病毒性传染病具有防御和抑制作用，为病毒性疾病的防治带来了新的希望，为养鸭业提供了有利的安全保障条件，其应用研究，则为开发鸭干扰素拓展了更加广阔的空间。鸭干扰素具有光谱抗病毒作用，主要通过直接激活免疫细胞核间接抑制病毒复制而达到抗病毒作用；同时，它还具有抗细胞内寄生的细菌、立克次氏体、衣原体、原虫作用。主要通过下调转铁蛋白受体，直接抑制细胞内细菌等；免疫增强功能，通过刺激NK细胞、活化巨噬细胞增强其杀伤功能，并直接促进T、B细胞分化和CTL成熟，刺激B细胞分泌抗体，从而增强机体免疫功能。鸭的α干扰素基因最早是由德国研究人员Schultz等于1995年利用已报道的ChIFN-α基因作为探针经过克隆筛选得到。国内研究人员夏春2000年报道了北京鸭的α干扰素基因，其他研究人员后续报道了番鸭、绍兴鸭、麻鸭等各品种鸭的α干扰素基因，此外研究人员相继报道了重组鸭α干扰素对各种病毒的抵抗作用，Schultz等证实了重组干扰素有抵抗水泡型口炎病毒、A型流感病毒、鸭肝炎病毒和新城疫病毒的作用；周雪等2007年采用带有鸭α干扰素基因的质粒注射樱桃谷鸭后表现出一定的抗鸭瘟强毒感染的能力；PeiGao等2018年用重组鸭α干扰素治疗2日龄鸭来研究其对高致病性禽流感病毒H5N1的抵抗作用，结果显示与病毒对照组相比试验组的鸭死亡率从60％下降到10％，说明重组鸭α干扰素对2日龄鸭感染禽流感病毒H5N1具有抵抗作用。Yao等人2014年克隆并在293T细胞中表达出北京鸭Ⅲ型干扰素IFN-λ，其研究表明重组鸭λ干扰素可以上调原代鸭肝细胞内OASL和Mx-1的mRNA水平，与抗病毒防御和炎症反应密切相关，但未对鸭Ⅲ型干扰素IFN-λ的活性进行报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种鸭λ干扰素及鸭λ干扰素的突变体，所述鸭λ干扰素突变体具有高抗病毒活性；本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种利用家蚕杆状病毒表达系统制备所述鸭λ干扰素或鸭λ干扰素突变体的方法；本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供所述鸭λ干扰素或鸭λ干扰素突变体应用于预防或治疗鸭病毒性疾病。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术分析了NCBI上所有鸭λ干扰素氨基酸序列，最终确定以SEQIDNO.1所示的氨基酸序列为鸭λ干扰素原始氨基酸序列(即DuIFN-λ)，其编码基因的多核苷酸序列为(a)或(b)或(c)所示：(a)SEQIDNo.2所示的多核苷酸序列；或(b)与SEQIDNo.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；或(c)与SEQIDNo.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；优选的，与SEQIDNo.2的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；更优选的，与SEQIDNo.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性。本专利技术进一步通过对鸭λ干扰素所有氨基酸序列进行比对得到鸭λ干扰素的保守序列，该保守序列的氨基酸序列为SEQIDNo.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.4所示。本专利技术在鸭λ干扰素保守氨基酸序列(即SEQIDNO.3所示)的基础上，根据家蚕密码子偏好性对该基因序列进行优化，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变；为了提高在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因ATG前面加了Kozak序列ACGAAC。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI、SmaI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，在保持其氨基酸序列(即SEQIDNO.3所示)不变的前提下，得到优化后的基因(即：DuIFN-λ-C-O)，其核苷酸序列为SEQIDNO.5所示。抗病毒活性结果显示，在家蚕幼虫体内表达的DuIFN-λ效价为1.56×106U/mL，优化后基因(DuIFN-λ-C-O)效价为2.58×106U/mL。本专利技术进一步以DuIFN-λ-C-O的基因序列为模板设计多对引物，利用融合PCR法进行氨基酸单位点突变和氨基酸多位点突变，获得了多个鸭λ干扰素突变体；在DuIFN-λ-C-O的基础上，分别进行S30T、N56S、I95V、Q136K或V166L这5个位点单位点突变后，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭λ干扰素，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种鸭λ干扰素，其特征在于：其氨基酸序列为SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的鸭λ干扰素的编码基因，其特征在于，其多核苷酸序列为(a)、(b)或(c)所示：(a)SEQIDNo.2所示的多核苷酸序列；或(b)与SEQIDNo.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；或(c)与SEQIDNo.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；优选的，与SEQIDNo.2的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；更优选的，与SEQIDNo.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性。3.一种鸭λ干扰素的保守氨基酸序列，其特征在于：其氨基酸序列为SEQIDNo.3所示，其编码基因的多核苷酸序列为SEQIDNo.4所示。4.权利要求3所述的鸭λ干扰素的保守氨基酸序列的编码基因的优化序列，其特征在于：其多核苷酸序列为SEQIDNo.5所示。5.一种鸭λ干扰素突变体，其特征在于：将SEQIDNo.3所示的鸭λ干扰素的氨基酸序列进行A19V、S30T、Y41S、L48Q、K51R、N56S、P62S、T74K、L84I、I95V、D104H、F117L、G126D、Q136K、H143Y、S158G、V166L或H173N中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体；优选的，将SEQIDNo.3所示的鸭λ干扰素氨基酸序列进行S30T、N56S、I95V、Q136K或V166L中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体。6.一种鸭λ干扰素突变体，其特征在于：将SEQIDNo.3所示的鸭λ干扰素氨基酸序列进行S30T-N56S、S30T-I95V、S30T-Q136K、S30T-V166L、N56S-I95V、N56S-Q136K、N56S-V166L、I95V-Q136K、I95V-V166L、Q136K-V166L、S30T-N56S-I95V、S30T-N56S-Q136K、S30T-N56S-V166L、S30T-I95V-Q136K、S30T-I95V-V166L、S30T-Q136K-V166L、N56S-I95V-Q136K、N56S-I95V-V166L、N56S-Q136K-V166L、I95V-Q136K-V166L、S30T-N56S-I95V-Q136K、S30T-N56S-I95V-V166L、S30T-N56S-Q136K-V166L、S30T-I95V-Q136K-V166L、N56S-I95V-Q136K-V166L或S30T-N56S-I95V-Q136K-V166L中的任何一种氨基酸多位点突变所获得的突变体；优选的，将SEQIDNo.3所示的鸭λ干扰素氨基酸序列进行N56S-I95V、I95V-Q136K、N56S-I95V-Q136K或N56S-I95V-Q136K-V166L中任何一种氨基酸多位点突变所获得的突变体；最优选的，将SEQIDNo.3所示的鸭λ干扰素氨基酸序列进行N56S-I95V-Q136K-V166L氨基酸多位点突变所获得的突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO.6所示，其编码基因的多核苷酸序列为SEQIDNO.7所示。7.含有权利要求2-4任何一项所述鸭λ干扰素的编码基因的重组载体或重组宿主细胞。8.权利要求1所述鸭λ干扰素或者权利要求2所述鸭λ干扰素的保守氨基酸序列在制备预防或治疗鸭病毒性疾病的药物或试剂中的用途。9.按照权利要求8所述的用途，其特征在于，所述鸭病毒性疾病包括：雏鸭病毒性肝炎、鸭病毒性肠炎、小鹅瘟、番鸭细小病毒病、雏番鸭小鹅瘟、鸭流行性出血症或黑羽病、鸭花肝病、鸭病毒性脑炎、...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡小元，张志芳，刘兴健，易咏竹，李轶女，王朋，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11