一种固定化酶及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种固定化酶及其制备方法，其以甲壳素纳米纤维为载体，所述酶通过共价连接固定在该载体上；其中，所述甲壳素纳米纤维的羟基氧化为羧酸基团，用于酶与所述甲壳素纳米纤维的共价连接。本发明专利技术通过将甲壳素纳米纤维的羟基氧化为羧酸基团，从而使得酶可以通过羧酸基团进行共价连接，从而固定在载体上，辅助用交联剂进一步固定所述酶，两种方法配合，使得酶的固定量进一步增大，酶的稳定性提高，还提高了酶的催化效率。

An immobilized enzyme and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种固定化酶及其制备方法
本专利技术属于纳米材料领域，涉及一种固定化酶及其制备方法，具体地，涉及一种以甲壳素为载体的固定化酶及其制备方法。
技术介绍
酶作为生物催化剂，在医药，食品，化工等领域有着广阔的研究和应用前景，但是酶在催化过程中的不稳定性，但是天然酶稳定性差、容易失活、不能回收，且反应后混入产物等问题限制了酶的应用。酶的固定化是用固体材料将酶分子限制在一定区域内的一项技术，固定化酶技术提高了酶的稳定性，实现了酶的重复使用，降低了成本。酶固定化方法根据载体，操作方法的不同，以及固定化的机理，主要可分为吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法和微囊法等。吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶固定化的方法，操作简单，条件温和，对酶活保持较好，但是由于物理吸附作用力较弱，固定的酶易流失；交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法，虽然固定的酶很牢固但是由于交联条件苛刻，酶分子易失活。现在越来越多的固定方法并不局限于单一方法的使用，而是根据需要来复合使用两种及两种以上的固定法以达到制备有两固定化材料的目的。目前，已经开发了很多不同的纳米材料，包括纳米颗粒，纳米管，纳米纤维等。其中，纳米纤维具有在反应体系中的分散性高，易回收，高表面积体积比以及优秀的物理性质等优点，因此得到了广泛的应用。甲壳素是一种天然高分子化合物，存在于水生甲壳类动物，例如虾蟹等的外壳中，分布非常广泛。甲壳素(chitin)又称甲壳质、几丁质、壳多糖，是N-乙酰氨基葡萄糖单位通过β-1,4-糖苷键连接而成的直链多糖，为白色片状固体，无毒，无味，耐酸碱，耐腐蚀，耐高温，耐日光，性能十分稳定，是迄今为止发现的唯一天然碱性多糖。它大量存在于低等动物特别是节肢动物的甲壳中，是自然界中储备量仅次于纤维素的第二大天然可再生资源。同时由于戊二醛对物质有很强的穿透力，利用它对甲壳素进行处理后，甲壳素的表面形成有机多孔结构，有利于酶的吸附。而且戊二醛为活泼的双功能试剂，它不仅与酶蛋白的氨基、羧基反应，还能活化甲壳素所具有的氨基。不仅如此，甲壳素还具有很好的生物可降解性，可再生性，可持续性等优点，因此，甲壳素是一种很好的酶固定化载体。CN101050457A公开了一种甲壳素-戊二醛交联吸附固定壳聚糖酶的制备方法，它包括甲壳素载体的精制、交联剂的配制、甲壳素-戊二醛的交联、壳聚糖酶的提取及固定等步骤。CN103966277A公开了一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，该方法以甲壳素为载体，以戊二醛为交联试剂，固定游离磷脂酶D得到磷脂酶D的固定化酶。上述方法都是采用戊二醛交联固定相应的酶，其固定量小，不稳定，不能实现回收利用。因此，提供一种新型环保功能化的磁性甲壳素纳米纤维，用于将酶固定在其上就显得尤为重要。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术旨在提供一种固定化酶及其制备方法，所述固定化酶采用甲壳素纳米纤维作为载体，通过共价键固定连接，从而使得酶的固定更加稳定，固定量增大。为达此目的，本专利技术采用了以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种固定化酶，其以甲壳素纳米纤维为载体，所述酶通过共价连接固定在该载体上；其中，所述甲壳素纳米纤维的羟基氧化为羧酸基团，用于酶与所述甲壳素纳米纤维的共价连接。本专利技术中，通过将甲壳素纳米纤维的羟基氧化为羧酸基团，从而使得酶可以通过羧酸基团进行共价连接，从而固定在载体上，提高了酶的固定量，提高了酶的稳定性，从而也使得酶催化反应效率提高。根据本专利技术，所述甲壳素纳米纤维的C6上的伯羟基氧化为羧酸基团，本专利技术中，专利技术人发现将甲壳素纳米纤维C6上的伯羟基进行氧化，其最容易实现，与酶连接效果最好，能够最大程度地将酶固定在所述载体上。优选地，所述甲壳素纳米纤维的长度为30-300nm，其长度由反应的pH和次氯酸钠的浓度决定，例如可以是30nm、32nm、35nm、38nm、40nm、42nm、45nm、48nm、50nm、51nm、52nm、53nm、55nm、56nm、58nm、60nm、62nm、65nm、68nm、70nm、72nm、75nm、78nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、220nm、250nm、280nm或300nm，优选为50-200nm。本专利技术中，专利技术人发现当甲壳素纳米纤维过长的时候，其在水溶液中的分散性不好，影响后续酶的催化反应，当甲壳素纳米纤维过短的时候，甲壳素纳米纤维上的酶量少，其催化效果不佳。优选地，所述酶为糜蛋白酶、α琼胶酶、β琼胶酶、磷脂酶D、脂肪酶或虾青素酯酶中的任意一种或至少两种的组合，所述组合例如可以是糜蛋白酶和α琼胶酶的组合，α琼胶酶和β琼胶酶的组合，磷脂酶D和脂肪酶的组合，脂肪酶和虾青素酯酶的组合，糜蛋白酶、α琼胶酶和β琼胶酶的组合，糜蛋白酶、α琼胶酶、β琼胶酶和磷脂酶D的组合，α琼胶酶、β琼胶酶、磷脂酶D和脂肪酶的组合，糜蛋白酶、α琼胶酶、β琼胶酶、磷脂酶D、脂肪酶和虾青素酯酶的组合。根据本专利技术，所述载体上还修饰有氨基化的磁性纳米材料。优选地，所述磁性纳米材料为四氧化三铁、氧化硅或氧化铝中的任意一种或至少两种的组合，优选为四氧化三铁。本专利技术中，通过在载体上修饰氨基化的磁性纳米材料，可以使得所述固定化酶重复利用，使酶可以反复进行多次反应，可以有效与产物分离，避免酶对产物的污染。优选地，所述酶还通过交联作用与所述甲壳素纳米纤维载体相连，所述交联通过交联剂实现，所述交联剂为戊二醛。本专利技术中，通过交联剂进一步固定所述酶，两种方法配合，使得酶的固定量进一步增大，提高了酶的催化效率。第二方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的固定化酶的制备方法，包括如下步骤：(1)制备甲壳素纳米纤维，氧化其羟基，并进行活化；(2)加入酶与步骤(1)活化后的甲壳素纳米纤维反应，进行固定，得到所述固定化酶。根据本专利技术，步骤(1)具体包括如下步骤：(1’)将甲壳素、TEMPO(四甲基哌啶氮氧化物)、溴化钠和次氯酸钠混合后，搅拌反应；(2’)将反应后的混合物离心，收集沉淀，纯化后进行破碎；(3’)将破碎后的甲壳素纳米纤维通过EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/NHS(N-羟基丁二酰亚胺)反应进行活化。根据本专利技术，所述甲壳素的质量浓度为8-15g/L，例如可以是8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L，优选为9-12g/L。优选地，所述TEMPO的摩尔浓度为0.5-3mM，例如可以是0.5mM、0.6mM、0.8mM、1mM、1.2mM、1.3mM、1.5mM、1.8mM、2mM、2.1mM、2.3mM、2.5mM、2.6mM、2.8mM或3mM，优选为0.8-2mM。优选地，所述溴化钠的摩尔浓度为5-15mM，例如可以是5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或15mM，优选为8-12mM。优选地，所述次氯酸钠的摩尔浓度为5-15mM，例如可以是5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固定化酶，其特征在于，其以甲壳素纳米纤维为载体，所述酶通过共价连接固定在该载体上；其中，所述甲壳素纳米纤维的羟基氧化为羧酸基团，用于酶与所述甲壳素纳米纤维的共价连接。

【技术特征摘要】
1.一种固定化酶，其特征在于，其以甲壳素纳米纤维为载体，所述酶通过共价连接固定在该载体上；其中，所述甲壳素纳米纤维的羟基氧化为羧酸基团，用于酶与所述甲壳素纳米纤维的共价连接。2.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述甲壳素纳米纤维的C6上的伯羟基氧化为羧酸基团；优选地，所述甲壳素纳米纤维的长度为30-300nm，优选为50-200nm；优选地，所述酶为糜蛋白酶、α琼胶酶、β琼胶酶、磷脂酶D、脂肪酶或虾青素酯酶中的任意一种或至少两种的组合。3.根据权利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于，所述载体上还修饰有氨基化的磁性纳米材料；优选地，所述磁性纳米材料为氨基功能化四氧化三铁、氧化硅或氧化铝中的任意一种或至少两种的组合，优选为四氧化三铁；优选地，所述酶还通过交联作用与所述甲壳素纳米纤维载体相连；优选地，所述交联通过交联剂戊二醛实现。4.一种如权利要求1-3中任一项所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备甲壳素纳米纤维，氧化其羟基，并进行活化和磁性修饰；(2)加入酶与步骤(1)活化后的甲壳素纳米纤维反应，进行固定，得到所述固定化酶。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括如下步骤：(1’)将甲壳素、TEMPO、溴化钠和次氯酸钠混合后，搅拌反应；(2’)将反应后的混合物离心，收集沉淀，纯化后进行破碎；(3’)将破碎后的甲壳素纳米纤维通过EDC/NHS反应进行活化。6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述甲壳素的质量浓度为8-15g/L，优选为9-12g/L；优选地，所述TEMPO的摩尔浓度为0.5-3mM，优选为0.8-2mM；优选地，所述溴化钠的摩尔浓度为5-15mM，优选为8-12mM；优选地，所述次氯酸钠的摩尔浓度为5-15mM，优选为8-12mM；优选地，所述反应的pH为10-11，优选为10-10.5。7.根据权利要求4-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2’)中离心的转速为6000-15000rpm，优选为8000-12000rpm；优选地，步骤(2’)中离心的时间为5-15min，优选为8-12min；优选地，步骤(2’)所述破碎采用超声破碎；优选地，步骤(2’)所述超声破碎的功率为200-500W，优选为300-400W；优选地，步骤(2’)所述超声破碎的时间为20-40min，优选为25-35min；优选地，所述EDC的质量浓度为5-15mg/mL，优选为8-12mg/mL；优选地，所述NHS的质量浓度为40-60mg/mL，优选为...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛相朝，黄文灿，薛长湖，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37