基于通过单荧光膜染色和流动细胞分析的独特光谱强度比分析的快速抗微生物敏感性测试方法技术

本发明专利技术公开了单染料荧光染色以及强度和光谱发射的差异的组合允许确定灭活细菌所需的抗生素的最小浓度(最小抑制浓度(MIC))，从而提供快速抗生素敏感性测试(AST)的手段。这使得临床医生能够快速且简便地确定患有细菌感染的患者和最终导致败血症的患者的合适治疗方案。

A Rapid Antimicrobial Sensitivity Test Method Based on Unique Spectral Intensity Ratio Analysis by Single Fluorescent Membrane Staining and Flow Cell Analysis

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于通过单荧光膜染色和流动细胞分析的独特光谱强度比分析的快速抗微生物敏感性测试方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年1月9日提交的名称为“基于流式细胞术的独特光谱强度比(SIR)分析直接从血液培养物中快速抗菌药物敏感性测试方法”的美国临时专利申请62/443,850和分别于2017年5月10日和2017年5月11日提交的名称为“基于独特光谱强度比分析通过单荧光膜染料染色和流式细胞仪直接从阳性血液培养物中快速革兰氏阴性抗菌药物敏感性测试方法”的美国临时专利申请62/504,205和62/504,903的权益。本申请另外要求2017年1月9日提交的名称为“基于流式细胞术的独特光谱强度比(SIR)分析的临床分离物的快速抗微生物敏感性测试方法”的美国临时专利申请62/443,854和分别于2017年5月10日和2017年5月11日提交的题为“利用单荧光膜染料染色和流式细胞术的独特光谱强度比分析的快速抗生素敏感性测试方法”的美国临时专利申请62/504,152和62,504,851的权益。上述临时申请通过引用整体并入本文中。
细菌感染的强度可以根据引起感染的微生物和微生物的毒力而变化。因此，微生物的鉴定对于正确治疗是至关重要的。例如，败血症每年在全球影响的人数超过2600万人，是儿童的最大杀手-每年超过500万(例如，参见https://www.sepsis.org/faq/"SepsisFactSheet")。在全球范围内，重症监护病房中败血症的死亡率为40％至60％，其中一个原因是患者最初接受了不适当的抗生素治疗(https://www.medicinenet.com/sepsis/article.htm)。这很大程度上是因为即使在最先进的临床微生物实验室中，也需要数天才能获得病原体类型的严格诊断。此外，最初接受不正确治疗的患者的生存率低于在疾病早期接受最佳治疗的患者，预期寿命缩短，更容易受到生活质量下降的影响(https：//www.sepsis.org/faq/"SepsisFactSheet")。用于检测微生物感染的当前现有技术在过去30年中基本上保持大部分不变，是在医院或商业临床微生物学实验室中培养血液。在16至30小时内，液体培养物可以检测流体中某些类型的生长生物的存在。该测定法不是定量的，并且在不了解病原体类型及其特异性抗生素敏感性的情况下，仅可施用广谱抗生素，其最多是次优的。为了鉴定病原体的特定类型，并进行灵敏度测试以确定它们对各种潜在抗生素疗法的反应，必须将在液体培养基中生长的病原体转移到其他生长培养基(例如琼脂平板)中。完全诊断和敏感性测试的总时间通常为3-7天，并且基于临床症状的经验性抗生素治疗在获得抗生素敏感性结果之前就开始了。因此，快速且可靠的诊断和治疗方法对于有效的患者护理是必须的。不幸的是，如上所述，目前的抗微生物药敏试验技术通常需要通过培养预先分离微生物(例如，约12至约48小时)，然后需要另外约6至约24小时的处理过程。例如，关于感染类型的确诊诊断传统上需要微生物学分析，包括接种血培养物，培养16-24小时，将致病微生物铺在固体培养基上，另一个潜伏期，以及1-2天后的最终鉴定。即使采用及时和积极的治疗，这也会显著影响患者的预后，具体取决于感染的类型，并且在某些情况下会导致死亡。在给予正确治疗之前失去的每小时可以对患者结果产生重大影响。因此，对于医生而言，快速确定引起感染的确切微生物以及哪种抗生素对治疗有效是很重要的。鉴于目前的方法可能需要两天或更长时间才能得出答案，因此非常需要更快速的抗生素敏感性测试，优选能够在抽取血液样本后数小时内识别特定抗生素敏感性的测试。例如，抽取血样后1-3小时、1-5小时、1-10小时、小于24小时或24小时后。在另一个例子中，在抽取血样并且鉴定为细菌感染阳性后24小时。因此，这种类型的快速测试将允许医生从一开始就发起最佳药物治疗，而不是从次优或完全无效的抗生素开始，从而大大提高了临床反应性。在细菌感染患者治疗中遇到的另一个问题是抗生素抗性的结果。当微生物(即细菌和/或细菌菌株)自发地或通过基因转移获得基因突变时，发生抗微生物(即抗菌)抗性，使其对一种或多种抗菌剂即抗生素的处理具有抗性。耐药性生物体可能获得对一线抗生素的抗性，因此需要使用微生物敏感的二线药物。在一些已经获得对多种药物的抗性的细菌菌株的情况下，依次获得对第二和甚至第三线抗生素的抗性。抗性可以采取自发或诱导基因突变的形式，或通过经由缀合、转导或转化的水平基因转移从其他细菌物种中获得抗性基因。许多抗生素抗性基因存在于可传播的质粒上，促进它们的转移。抗生素抗性质粒通常含有赋予对几种不同抗生素的抗性的基因。在临床实践中看到的抗生素抗性细菌感染率的增加源于人类和兽医学中的抗生素使用。任何抗生素的使用都会增加细菌群体的进化选择压力，使抗性细菌茁壮成长，非抗性细菌死亡。随着对抗生素的抗性变得越来越普遍，出现了对替代治疗的更大需求。抗生素耐药性对公众健康构成了严重且日益增长的全球性问题。随着越来越多的细菌菌株对抗生素具有抗性，需要药物帮助的个体无法获得所需的适当治疗。因此，除了确定适当的药物治疗之外，确定待施用的药物治疗的浓度/剂量也是至关重要的。因此，本专利技术的一个目的是提供：1)快速、迅速地测定微生物的抗生素敏感性，和2)抑制微生物所需的最小浓度。
技术介绍
现有的抗微生物敏感性测试(AST)技术是漫长的过程。一般而言，目前用于鉴定、分离和区分具有和不具有抗生素抗性基因的细菌菌株的实践通常涉及微生物学实验室中的复杂且漫长的过程。在目前的过程中，含有细菌的生物样本首先被接受进入实验室。诸如BDPhoenix和bioMerieuxVitex2系统的系统可用于以本领域已知的方法检测细菌菌株。在另一种方法中，然后使用无菌环将生物样本划线在含有营养丰富的培养基(例如，溶原性液体培养基或任何其它合适的液体培养基)的琼脂平板上。该琼脂平板含有已经用抗生素处理过的斑点。一旦样本在板上划线，将琼脂板放入专用培养箱中至少12小时。然后定期检查琼脂平板的细菌菌落生长。正如本领域普通技术人员所理解的，如果生物样本含有细菌，则预期在不含抗生素的斑点上存在细菌菌落生长。如果细菌没有获得抗生素抗性基因，则不期望在含有抗生素的斑点上生长。然而，如果细菌菌株已获得抗生素抗性基因，则在用抗生素处理的斑点上将发生菌落生长。参见例如共同拥有的美国专利申请公开号No.2008/0220465。在另一个过程中，收集后的生物样本被分类、标记，然后使用灭菌环接种到含有血琼脂培养基的玻璃圆底试管或任何其他合适的营养丰富的生长培养基(例如，溶原性液体培养基)中。然后将样本插入专用培养箱中12至24小时。然后观察样本并筛选阳性(即含有细菌)和阴性(即不含细菌)培养物。处理似乎含有阳性培养物的样本，以便将细菌分离并悬浮在生化液中。该过程涉及悬浮、稀释、涡旋和浊度测量，从而产生生化废物。然后对培养物进行种类鉴定和抗生素敏感性试验，将细菌悬浮液暴露于多种试剂中。经过6到24小时的潜伏期后，实验室技术人员会对结果进行解释和报告。整个过程通常需要至少11个或更多个步骤并且至少50个小时以获得样本结果，并且该过程是劳动密集型的。区分和鉴定细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于测定样本中一种或多种细菌的最小抑制浓度的方法，包括以下步骤：a.在多个容器中制备多种细菌悬浮液；b.将不同浓度的抗微生物剂添加到步骤a中，从而产生包含细菌和抗微生物剂组合的多种悬浮液；c.培养步骤b中包含细菌和抗微生物剂组合的多种悬浮液，在合适的培养温度下保持合适的一段培养时间，从而产生多种培养的悬浮液，其包含细菌和抗微生物剂的组合；d.将单膜相关染料加入到步骤c的悬浮液中；e.用一种或多种激发波长的入射光照射步骤d的悬浮液；f.在每种悬浮液的两个发射波长处测量发射光的强度；g.依据步骤f的每种悬浮液来测定光谱强度比；以及h.通过确定作为抗微生物浓度的函数的光谱强度比(SIR)来测定基于步骤g的最小抑制浓度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.09 US 62/443,850;2017.01.09 US 62/443,854;1.一种用于测定样本中一种或多种细菌的最小抑制浓度的方法，包括以下步骤：a.在多个容器中制备多种细菌悬浮液；b.将不同浓度的抗微生物剂添加到步骤a中，从而产生包含细菌和抗微生物剂组合的多种悬浮液；c.培养步骤b中包含细菌和抗微生物剂组合的多种悬浮液，在合适的培养温度下保持合适的一段培养时间，从而产生多种培养的悬浮液，其包含细菌和抗微生物剂的组合；d.将单膜相关染料加入到步骤c的悬浮液中；e.用一种或多种激发波长的入射光照射步骤d的悬浮液；f.在每种悬浮液的两个发射波长处测量发射光的强度；g.依据步骤f的每种悬浮液来测定光谱强度比；以及h.通过确定作为抗微生物浓度的函数的光谱强度比(SIR)来测定基于步骤g的最小抑制浓度。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤h中所述函数是阶跃函数，其形式为：其中，a是比例参数，b确定阶跃斜率，c是MIC值。3.如权利要求1所述的方法，其中所述单膜相关染料是苯乙烯基染料或花青染料。4.如权利要求1所述的方法，其中所述单膜相关染料是FM1-43。5.如权利要求1所述的方法，其中所述一个激发波长是选自360nm和570nm的范围之间的波长。6.如权利要求1所述的方法，其中所述一个发射波长是选自520nm和850nm的范围之间的波长。7.如权利要求1所述的方法，其中所述样本是体液。8.如权利要求7所述的方法，其中所述样本是血液或尿液。9.如权利要求1所述的方法，其中所述样本是临床分离物。10.如权利要求1所述的方法，其中所述合适的培养温度介于35℃至40℃之间。11.如权利要求1所述的方法，其中所述合适的一段培养时间为30分钟至5小时。12.如权利要求1所述的方法，其中不同浓度的抗微生物剂是指通过连续稀释制备的所述抗微生物剂。13.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：加尔·因格贝尔，摩西·本大卫，穆什基·弗里德曼，耶尔·格鲁克曼，蒂娜·戈曼，奥莉·汗莫·蒙茨，安妮塔·辛德曼，伊兰·扎哈维，
申请(专利权)人：普凯尔德诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列,IL