一种高灵敏度双光子红发射线粒体靶向型荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及精细化工领域，具体地说涉及一种双光子红发射线粒体靶向型荧光探针的设计合成及其在细胞中的应用。所述荧光探针的结构如式

A Two-photon Red Emission Mitochondrial Targeted Fluorescent Probe with High Sensitivity and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏度双光子红发射线粒体靶向型荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及精细化工领域，具体地说涉及一种高灵敏度双光子红发射线粒体靶向型荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
硫化氢作为细胞环境中的一种重要的气体信号分子，与多种病理过程有关，据报道，阿尔茨海默症的发病机理与线粒体中硫化氢水平密切相关。近年来，分子荧光探针因为其高灵敏度、高选择性和反应迅速等优点，得到迅速发展。大多数都是用高能量的单光子激发的单光子荧光探针，后来，以低能量的双光子作为激发源的双光子荧光探针因为其局域激发、穿透深度深、组织自荧光和自吸收低等显著优点获得较多关注。与单光子相比，双光子激发过程就是基态荧光分子同时吸收两个光子激发至激发态，通过弛豫过程，辐射出频率略小于两倍入射光频率的荧光光子。而在双光子激发情形下，可采用光损伤较小的红外或近红外光，由于激发光源波长较长，受光散射影响较小，使得入射光的损耗较小，在介质中的穿透性较好，而且双光子荧光可以避免普通荧光成像中的光漂白问题和对生物细胞的光致毒问题。因此，开发一种高灵敏的双光子红发射线粒体靶向型硫化氢检测荧光探针具有较重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于合成一种双光子红发射线粒体靶向型硫化氢检测荧光探针，所述探针。本专利技术的另一目的在于提供上述双光子红发射线粒体靶向型硫化氢检测荧光探针的合成方法及其在细胞中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案：高灵敏双光子红发射线粒体靶向型硫化氢检测荧光探针，所述荧光分子探针结构式如式所示：上述双光子红发射线粒体靶向型硫化氢检测荧光探针的合成采用以下步骤：(1)将3-7mL4-甲基吡啶和10-15mL乙醚混合均匀，然后加入1-5mL碘甲烷，用锡箔纸包住整个烧瓶进行避光处理，常温避光条件下，搅拌反应2-4h，得到白色固体，即1,4-二甲基吡啶碘化盐(产物1)。(2)6-羟基-2-萘甲醛(150-180mg)和1,4-二甲基吡啶碘化盐(220-250mg)溶于15-30mL乙醇中混合均匀。向混合溶液中加入少量哌啶，将圆底烧瓶放入加热套中进行加热回流，时间为10-15h。反应结束后停止加热，待溶液冷却至室温时进行抽滤。滤纸上所得的固体用无水乙醇进行洗涤，滤纸上出现淡黄色固体，即EMII(产物2)。(3)称量420-430mg产物2和200-210mg2,4-二硝基氟苯加入到5-10mL无水DMF中混合均匀，然后加入碳酸钾(260-280mg)，常温搅拌5-8h。将圆底烧瓶放置于油浴锅中，温度调至40-60℃，继续反应3-6h。反应结束后静置冷却至室温，加入适量的冰水，静置，抽滤。得到的灰色固体即荧光探针EMII-H2S(产率80％-90％)。一种上述双光子红发射线粒体靶向型荧光探针的应用，所述荧光探针在检测硫化氢中的应用。上述应用所采取的方法为：合成的分子荧光探针引入吡啶碘化盐结构作为线粒体靶向基团，而后引入2,4-二硝基氟苯作为反应基团，对硫化氢进行特异性识别。上述荧光探针可应用于检测血清、活细胞等生物样本中硫化氢含量，检测灵敏度高，结合了双光子、红发射、线粒体靶向等诸多优点，可应用于分析化学、生命有机分析化学、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。有益效果本专利技术制备的荧光探针结合了双光子/红发射/线粒体靶向/检测硫化氢的特性，在双光子激发情形下，采用光损伤较小的红外光，由于激发光源波长较长，受光散射影响较小，使得入射光的损耗较小，在介质中的穿透性较好，而且双光子荧光可以避免普通荧光成像中的光漂白问题和对生物细胞的光致毒问题。同时引入吡啶碘化盐结构作为线粒体靶向基团，实现了硫化氢检测的线粒体靶向性。附图说明图1为本专利技术线粒体靶向型荧光探针合成路线；图2探针的H谱；图3探针的C谱；图4细胞共聚焦成像图；图5荧光探针EMII-H2S(5μM)与200μM的NaHS的反应时间响应图；图6在不同pH条件下，荧光探针EMII-H2S(5μM)与待测物NaHS(200μM)反应的荧光响应；图7荧光探针EMII-H2S(5μM)与200μM的NaHS的在不同温度下反应的荧光强度；图8荧光探针EMII-H2S(5μM)加入不同浓度NaHS的荧光光谱图(NaHS浓度:0→200μM；图9荧光强度与待测物NaHS浓度之间的线性关系；图10干扰离子(100μM)对荧光探针EMII-H2S(5μM)荧光强度的影响。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行进一步的阐述，下述说明仅为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。实施例1双光子红发射线粒体靶向型硫化氢检测荧光探针的设计与合成：(1)将4mL4-甲基吡啶和12mL乙醚混合均匀，然后加入1.5mL碘甲烷，用锡箔纸包住整个烧瓶进行避光处理，常温避光条件下，搅拌反应2h，得到白色固体，即1,4-二甲基吡啶碘化盐(产物1)。(2)6-羟基-2-萘甲醛(172mg)和1,4-二甲基吡啶碘化盐(237mg)溶于20mL乙醇中混合均匀。向混合溶液中加入少量哌啶，将圆底烧瓶放入加热套中进行加热回流，时间为12h。反应结束后停止加热，待溶液冷却至室温时进行抽滤。滤纸上所得的固体用无水乙醇进行洗涤，滤纸上出现淡黄色固体，即EMII(产物2)。(3)称量427mg产物2和205mg2,4-二硝基氟苯加入到5mL无水DMF中混合均匀，然后加入碳酸钾(274mg)，常温搅拌6h。将圆底烧瓶放置于油浴锅中，温度调至50℃，继续反应4h。反应结束后静置冷却至室温，加入适量的冰水，静置，抽滤。得到的灰色固体即荧光探针EMII-H2S(产率80％-90％)。实施例2(1)将7mL4-甲基吡啶和15mL乙醚混合均匀，然后加入5mL碘甲烷，用锡箔纸包住整个烧瓶进行避光处理，常温避光条件下，搅拌反应4h，得到白色固体，即1,4-二甲基吡啶碘化盐(产物1)。(2)6-羟基-2-萘甲醛(180mg)和1,4-二甲基吡啶碘化盐(250mg)溶于30mL乙醇中混合均匀。向混合溶液中加入少量哌啶，将圆底烧瓶放入加热套中进行加热回流，时间为15h。反应结束后停止加热，待溶液冷却至室温时进行抽滤。滤纸上所得的固体用无水乙醇进行洗涤，滤纸上出现淡黄色固体，即EMII(产物2)。(3)称量430mg产物2和210mg2,4-二硝基氟苯加入到10mL无水DMF中混合均匀，然后加入碳酸钾(280mg)，常温搅拌8h。将圆底烧瓶放置于油浴锅中，温度调至50℃，继续反应5h。反应结束后静置冷却至室温，加入适量的冰水，静置，抽滤。得到的灰色固体即荧光探针EMII-H2S(产率85％-90％)。实施例3制备的探针与NaHS反应可行性验证：取5μΜ荧光探针EMII-H2S溶于DMSO中，向其中加入200μΜNaHS反应，出现荧光。实施例4细胞毒性的检测：在37℃温度条件下，将T24细胞放入含有10％胎牛血清(FBS，Invitrogen)的DMEM培养基中，并在含有5％CO2气体的湿润培养箱中，培育24h。将培养好的T24细胞接种至96孔细胞培养板中继续培养24h。然后加入浓度分别为0μM-40μM(梯度：10μM)的荧光探针EMII-H2S溶液中继续培养(24h)。然后,向每个孔中加入的甲基噻唑基四唑(MTT，25μL，5.0mg/mL)溶液，培育4h(37℃)后将过量M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高灵敏度双光子红发射线粒体靶向型荧光探针，其特征在于，其结构如式（1）所示：

【技术特征摘要】
1.一种高灵敏度双光子红发射线粒体靶向型荧光探针，其特征在于，其结构如式（1）所示：（1）。2.一种权利要求1所述双光子红发射线粒体靶向型荧光探针的合成方法，其特征在于，采用的合成步骤为：（1）在避光条件下将4-甲基吡啶和乙醚混合均匀，加入碘甲烷，搅拌反应2-4h，得到1,4-二甲基吡啶碘化盐（产物1）；（2）6-羟基-2-萘甲醛和1,4-二甲基吡啶碘化盐溶于乙醇中混合均匀，向混合溶液中加入哌啶，加热回流10-15h，待溶液冷却至室温时进行抽滤，滤纸上固体即EMII（产物2）；（3）称产物2和2,4-二硝基氟苯加入到无水DMF中混合均匀，然后加入碳酸钾，常温搅拌5-8h，升温至40-60℃，继续反应3-6h，反应结束后冷却至室温，加入冰水，静置，抽滤，得到荧光探针EMII-H2S。3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）所述的反应物6-羟基-2-萘甲醛和1，4-二甲基吡啶碘化盐物质的量之比为1：1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈光，薛俊莲，许洁，李璐，姜翱，刘振军，赵光辉，尤进茂，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37