哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别引物、鉴别方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别引物、鉴别方法及试剂盒，所述引物包括上游引物HtaC1041F和下游引物HtaC1041R；上游引物HtaC1041F的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物HtaC1041R的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术是国内外首次基于分子生物学技术原理建立的哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别的新方法，它利用哲罗鲑EST序列设计了1对SSR引物，通过一个PCR反应就可以实现哲罗鲑和细鳞鲑的鉴别。本发明专利技术可以区分哲罗鲑和细鳞鲑完整个体及其加工产品，且可以用于鱼卵、刚孵出苗种的鉴定，具有准确快捷、客观公正、经济实用的特点。

Primers, Identification Methods and Kits for Germplasm Identification of Salmon Phyllostachys and Salmon Fine Scale

【技术实现步骤摘要】
哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别引物、鉴别方法及试剂盒
本专利技术涉及哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别引物、鉴别方法及试剂盒，属于分子鉴定

技术介绍
哲罗鲑，学名Huchotaimen(Pallas)，分属哲罗鲑属。细鳞鲑，学名Brachymystaxlenok(Pallas)，分属细鳞鲑属。二者均隶属于鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)，是我国珍稀、名贵的冷水性鱼类。哲罗鲑和细鳞鲑属于濒危物种，1998年均被列入中国濒危动物红皮书，2004年被列入中国物种红色名录。为了保护和开发这两种珍稀、名贵鱼类，研究人员相继攻克了这2种鱼类的人工繁殖和苗种培育，成功进行了苗种规模化培育以及商品鱼养殖，丰富了我国水产养殖的品种。同时为了恢复野生资源，也在部分原栖息地进行了哲罗鲑和细鳞鲑的增殖放流。哲罗鲑和细鳞鲑是近缘物种，生活环境相似，成鱼根据外形易于区分，但幼鱼外形十分相近，很难从外形上对两者进行鉴别，因此极易出现哲罗鲑和细鳞鲑种质混杂，从而损害冷水鱼养殖产业的发展及哲罗鲑、细鳞鲑的资源增殖放流，因此亟需一种快捷、准确的哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对哲罗鲑和细鳞鲑幼鱼在外形上极难鉴别这一难题，提出了哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别引物以及利用上述鉴别引物建立哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别的方法、试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别引物，包括上游引物HtaC1041F和下游引物HtaC1041R；上游引物HtaC1041F的序列如SEQIDNO.1所示，下游引物HtaC1041R的序列如SEQIDNO.2所示。一种哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别方法，包括以下步骤：(1)剪取样本鱼的部分鳍条或鳞片，加入裂解液裂解，制备DNA粗提液；(2)以DNA粗提液为模板，利用引物进行PCR扩增；(3)将PCR扩增产物进行电泳，银染，再将电泳结果与标准图谱对比，进行鉴定。裂解液的主要成分为：蛋白酶K0.5mg/ml、Tris(pH8.0)10mM、KCl50mM、Tween200.3％(w/v)、NP-400.3％(w/v)。裂解条件为：55℃2h，98℃10min。PCR扩增的反应体系为：2×TaqPCRMix10μl、DNA粗提液2μl、10μM上下游引物各0.5μl，用超纯水补足20μl。PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环；72℃最后延伸5min。标准图谱中，哲罗鲑样本的条带为166bp；细鳞鲑样本的条带为158bp。在根据电泳结果无法确定样本鱼属于哲罗鲑或细鳞鲑时，将电泳条带大小相同的3-5个样本测序，根据序列SSR重复的次数与提供的SSR序列对比进行判定，哲罗鲑的SSR序列为：AGGC(AC)7ATGCACATACTG(AC)3AGT；细鳞鲑的SSR序列为：AGGC(AC)4GCACATACTG(AC)3AGT。鉴别哲罗鲑和细鳞鲑种质的试剂盒，包括上述引物。本专利技术有益效果：本专利技术是国内外首次基于分子生物学技术原理建立的哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别的新方法，它利用哲罗鲑EST序列设计了1对SSR引物，通过一个PCR反应就可以实现哲罗鲑和细鳞鲑的鉴别。本专利技术无需依赖专业的分类学背景，也不需要具有长期从事鱼类鉴别的丰富经验，不仅可以区分哲罗鲑和细鳞鲑完整个体，还可以鉴别其加工产品，具有准确快捷、客观公正、经济实用的特点。且可以用于鱼卵、刚孵出苗种的鉴定，能够研究哲罗鲑的群落结构、产卵位置及扩散途径，了解早期生活史，评估哲罗鲑和细鳞鲑资源，解决商品苗种及淡水产品市场上存在的标识错误等方面的问题。附图说明图1为哲罗鲑和细鳞鲑的标准图谱，图中HT为哲罗鲑，BL为细鳞鲑。图2为部分哲罗鲑和细鳞鲑样本电泳检测结果，图中HT为哲罗鲑样本，BL为细鳞鲑样本。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。实施例1、建立鉴别方法1、提取DNA剪取样本鱼的部分鳍条或5-10个鳞片，加入40μl裂解液(蛋白酶K0.5mg/ml、Tris(pH8.0)10mM、KCl50mM、Tween200.3％(w/v)、NP-400.3％(w/v))，55℃2h，98℃10min裂解，裂解后混匀，1000-2000rpm离心1-2min，提取上清液，即为DNA粗提液；2、设计引物根据哲罗鲑的EST序列设计了53对SSR引物，12对引物在哲罗鲑中没能扩增出条带，对能扩增出条带的41对引物进行筛选，发现HtaC1041引物具有特异性，引物序列为：上游引物HtaC1041F：5’-ACTTGGGCATTGGTAAAAGCT-3’(SEQIDNO.1)下游引物HtaC1041R：5’-AGGCATCATGAGAGTGCGTG-3’(SEQIDNO.2)哲罗鲑HtaC1041扩增序列：ACTTGGGCATTGGTAAAAGCTAATTACAAATTATCATTAATAACTTACAGTAATAAATACTTTAGGCAGTTTAAATGAAAATGACTGAAGGCACACACACACACACATGCACATACTGACACACAGTAAACATAAATCCTCTTTGACACGCACTCTCATGATGCCT(SEQIDNO.3)3、PCR扩增以DNA粗提液为模板，利用SSR引物HtaC1041进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为：2×TaqPCRMix10μl、DNA粗提液2μl、10μM上下游引物各0.5μl，用超纯水补足20μl。PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环；72℃最后延伸5min。4、电泳PCR反应结束后，取1.5μlPCR产物用8％的非变性聚丙烯凝胶电泳检测，220V，电泳3.0h，用0.2％的硝酸银染色10min，显色(500ml显色液配方：10gNaOH、0.2gNa2CO3、4ml甲醛，加水定容500ml)，照相并保存。根据电泳结果与提供的哲罗鲑和细鳞鲑标准图谱(图1)对比，鉴定样本鱼属于哲罗鲑或细鳞鲑。其中，哲罗鲑样本的条带为166bp；细鳞鲑样本的条带为158bp。5、SSR鉴别在根据电泳结果无法确定样本鱼属于哲罗鲑或细鳞鲑时，将电泳条带大小相同的3-5个样本测序，根据序列SSR重复的次数与提供的SSR序列对比进行判定，哲罗鲑的SSR序列为：AGGC(AC)7ATGCACATACTG(AC)3AGT(SEQIDNO.4)；细鳞鲑的SSR序列为：AGGC(AC)4GCACATACTG(AC)3AGT(SEQIDNO.5)。哲罗鲑的AC重复次数比细鳞鲑多3次，同时在AC重复7次后又多了AT，因此哲罗鲑比细鳞鲑大8bp。实施例2、样本检测利用实施例1的鉴别方法，采集不同流域根据形态鉴定为野生哲罗鲑的成鱼121尾和细鳞鲑的成鱼41尾，各取5-10个鳞片，进行鉴定。根据电泳结果与提供的哲罗鲑和细鳞鲑标准图谱对比，发现根据形态学鉴定为哲罗鲑的121份样本出现了一条大小为166bp的特异性条带，表明样本为哲罗鲑；根据形态学鉴定为细鳞鲑的41份样本均出现了158bp的特异性条带，表明样本为细鳞鲑样本(图2)，与形态学鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别引物，其特征在于，包括上游引物HtaC1041F和下游引物HtaC1041R；上游引物HtaC1041F的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物HtaC1041 R的序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别引物，其特征在于，包括上游引物HtaC1041F和下游引物HtaC1041R；上游引物HtaC1041F的序列如SEQIDNO.1所示，下游引物HtaC1041R的序列如SEQIDNO.2所示。2.一种利用权利要求1所述引物的哲罗鲑和细鳞鲑种质鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)剪取样本鱼的部分鳍条或鳞片，加入裂解液裂解，制备DNA粗提液；(2)以DNA粗提液为模板，利用引物进行PCR扩增；(3)将PCR扩增产物进行电泳，银染，再将电泳结果与标准图谱对比，进行鉴定。3.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，裂解液的主要成分为：蛋白酶K0.5mg/ml、Tris(pH8.0)10mM、KCl50mM、Tween200.3％(w/v)、NP-400.3％(w/v)。4.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，裂解条件为：55℃2h，98℃10min。5.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，PCR扩增的...

【专利技术属性】
技术研发人员：佟广香，唐国盘，匡友谊，尹家胜，张永泉，张庆渔，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23