一种筛选科宝肉鸡DNA条形码的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种科宝肉鸡DNA条形码“TCTACGGGC”在筛选科宝肉鸡中的应用，所述的科宝肉鸡DNA条形码由本发明专利技术方法筛选得到。本发明专利技术采用PCR直接测序的方法，利用生物信息学分析软件，从线粒体基因筛选到12S rRNA上特有的SNP位点和单倍型序列，再通过大群体验证获得了一条科宝肉鸡特异的DNA条形码序列，该DNA条形码突破了传统微卫星分子标记检测周期长、费用高等缺点，可用于快速简捷检测地方品种中是否杂入了科宝肉鸡的血统，以及科宝肉鸡纯种的验证分析。

A Method for Screening DNA Barcode of Kebao Broiler and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种筛选科宝肉鸡DNA条形码的方法及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种筛选科宝肉鸡DNA条形码的方法及DNA条形码的应用。
技术介绍
广西具有丰富的地方鸡种质资源，目前列入中国家禽品种资源志的广西地方鸡品种有6个，分别是广西三黄鸡、霞烟鸡、广西麻鸡(灵山香鸡和里当鸡)、南丹瑶鸡、广西乌鸡(东兰乌鸡和凌云乌鸡)、龙胜凤鸡。广西这些地方品种具有优良的肉品质和蛋品质，广西三黄属肉蛋兼用型品种，鸡饲养量居全国优质肉鸡首位，年产销量超过3.5亿只，肉质细嫩、气味香浓。南丹瑶鸡属肉蛋兼用型品种体型紧凑、肉质结实细嫩、肉味鲜美、皮薄、蛋品质好等优良特性。广西乌鸡包括东兰乌鸡和凌云乌鸡，体型中等，属肉蛋兼用型品种，肉质鲜美，营养丰富，同时具有较高的药用价值。霞烟鸡属肉用型鸡种具有肉质肥嫩，骨细而软，味道香甜的特点。龙胜凤鸡体躯较短，结构紧凑，外观清秀亮丽，肉质细嫩香醇，野性十足。广西地方鸡品种是培育优质肉鸡的良好素材，利用广西地方鸡品种配套杂交生产的配套系，能保留肉质鲜美，在一定程度上提高生长速度，但是仍然不能满足一些地方对大体型优质鸡的需求，为了实现黄羽肉鸡的快速生长，有些企业直接将地方品种与快速生长鸡品种进行杂交，来提高生长速度。通过这种杂交的方法，虽然可以在短时间内提高肉鸡的生长速度，但也带来了，肉品质下降、脚肿等一系列问题，有些公司也遭到客户的投诉。由此可知，仅通过体型外貌特征，很难判断是否杂入快大鸡的血统。微卫星分子标记和线粒体D-Loop区序列可有效将不同血缘关系的品种检测出来，微卫星分子标记是以1-6个碱基为核心序列，首尾相连组成的串联重复列，广泛存在于真核生物的基因组中，平均每50-150kb就存在一个微卫星位点，因此，利用微卫星分子标记可有效准确的检测群体的遗传结构特征，判断品种间的亲缘关系、保种效果以及种群近期是否经历瓶颈效应。线粒体D-Loop区序列是线粒体基因组DNA变异最大的区域，进化速率是其他序列的5-10倍，在进化的过程中会积累了较多的突变，如碱基替换、插入、缺失和一些串联重复序列。因此，根据线粒体D-Loop区序列的变异信息来评估品种的亲缘关系和是否有其他品种的渗入，利用微卫星分子标记和线粒体D-loop区序列虽然可准确的判断品种是否杂入外来品种血统，但是这些方法操作复杂、耗时长、且成本高，不利于在生产中推广应用。DNA条形码技术的出现为家禽品种的鉴别提供了新的手段，通过DNA条形码技术可实现快速、便宜和准确的对物种的鉴定，有利于生产的应用和推广。DNA条形码标记技术与微卫星标记技术相比，不但准确而且经济，操作性强，动物中常用的基因有细胞色素氧化酶I(COI)、细胞色素b(Cytb)、12SrRNA，16SrRNA，细胞色素氧化酶II(COII)和NADH脱氢酶I(ND1)基因等。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术中遗传资源鉴定方法中体型外貌特征法快速、便宜，但准确率低；微卫星标记法准确率高，但慢而且贵的技术问题，专利技术一种筛选科宝肉鸡DNA条形码的方法，并利用筛选到的科宝肉鸡DNA条形码鉴别科宝肉鸡的具体应用，以寻求得到一种准确、快速、便宜，易于在生产中应用推的技术和方法。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：一种科宝肉鸡DNA条形码“TCTACGGGC”在筛选科宝肉鸡中的应用。其中，所述的科宝肉鸡DNA条形码由下列方法筛选得到：(1)选择不同公司提供的不同品种纯种鸡以及科宝肉鸡作为试验对象，每个品种选择50个个体采集血液，并进行基因组DNA提取(参照《分子克隆实验指南IV》)；(2)根据已有的DNA条形码的研究，选择具有参考意义的线粒体基因(12SrRNA)用于DNA条形码的筛选；(3)设计候选线粒体基因PCR扩增的特异引物，对每个品种的DNA混合池进行PCR扩增，并送给生物公司进行测序，以获得每个品种候选基因的详细序列信息；(4)比对所有品种DNA池的测序结果，记录不同品种的序列变异信息，寻找一些特异的SNP位点；先针对各品种DNA混合池进行全序列扩增，筛选SNP位点，再重设目的片段，主要目的是为了解决由候选基因序列过长导致的测序成本升高的问题；(5)将SNP集中区域作为目的片段，设计引物并对所有个体的DNA样品进行PCR扩增；(6)基于选择的目的片段进行单倍型分析，筛选不同品种鸡所具有的单倍型序列；(7)排除科宝肉鸡与其他品种共有的单倍型基因序列，筛选其独有的单倍型，作为科宝肉鸡独有的DNA条形码，并以此作为鉴定科宝肉鸡的标准；(8)比对获得其他品种鸡所特有的单倍型序列，分析每一种单倍型的比例和其作为品种专用DNA条形码的可行性；(9)由12SrRNA基因的+391,+397,+470,+692,+715,+720,+721,+725,+769位点组成的单倍型“TCTACGGGC”即为科宝肉鸡DNA条形码。其中，步骤(3)中所述的特意引物为12SrRNA-full-F：5’-TATCCGCATCCCAGTGAA-3’,12SrRNA-full-R：5’-CTAAGTGCACCTTCCGGTAC-3’；引物特异性低可能会导致假阳性的情况发生，应注意辨别PCR扩增电泳结果的片段大小；另外，该步骤的主要目的是为了检验各品种的SNP突变情况，为步骤(4)、(5)做准备。其中，步骤(4)中筛选到SNP位点在12SrRNA基因的300～900bp范围内。其中，步骤(5)中所述的设计引物为12SrRNA-target-F：5’-ACATGTTATCTGCACCAGCT-3’，12SrRNA-target-R：5’-AAATCCTCCTTCTAAGGGCG-3’。本专利技术采用PCR直接测序的方法，利用生物信息学分析软件，从线粒体基因筛选到12SrRNA上特有的SNP位点和单倍型序列，再通过大群体验证获得了一条科宝肉鸡特异的DNA条形码序列，该DNA条形码突破了传统微卫星分子标记检测周期长、费用高等缺点，可用于快速简捷检测地方品种中是否杂入了科宝肉鸡的血统，以及科宝肉鸡纯种的验证分析。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)准确：本专利技术是基于分子水平的，可精准判段每个个体的基因型，从而确定是否含有科宝肉鸡血统；(2)简便：整个检测过程只需一次PCR和测序，就可完成对个体的检测，而微卫星检测每个样品需检测30个位点，跑30次PCR；(3)便宜：用该方法检测一个样本的成本约15元，而利用微卫星方法进行检测的话，一条微卫星荧光引物平均约400，检测位约30个位点，引物合成费为12000元，微卫星检测费800元/96孔。附图说明图1为实施例1中线粒体12SrRNA基因全序列梯度PCR琼脂糖凝胶电泳结果，其中1、2、3、4、5、6、7、8分别表示63.0℃、62.0℃、60.4℃、57.9℃、55.0℃、52.5℃、50.9℃、50.0℃。图2为实施例1中线粒体12SrRNA基因部分片段梯度PCR琼脂糖凝胶电泳结果，其中1、2、3、4、5、6、7、8分别表示63.0℃、62.0℃、60.4℃、57.9℃、55.0℃、52.5℃、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种科宝肉鸡DNA条形码，其特征在于：所述科宝肉鸡DNA条形码“TCTACGGGC”在筛选科宝肉鸡中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种科宝肉鸡DNA条形码，其特征在于：所述科宝肉鸡DNA条形码“TCTACGGGC”在筛选科宝肉鸡中的应用。2.根据权利要求1所述的科宝肉鸡DNA条形码，其特征在于，所述的科宝肉鸡DNA条形码由下列方法筛选得到：(1)选择不同公司提供的不同品种纯种鸡以及科宝肉鸡作为试验对象，采集血液，并进行基因组DNA提取；(2)根据已有的DNA条形码的研究，选择线粒体基因(12SrRNA)用于DNA条形码的筛选；(3)设计候选线粒体基因PCR扩增的特异引物，对每个品种的DNA混合池进行PCR扩增，测序，以获得每个品种候选基因的详细序列信息；(4)比对所有品种DNA池的测序结果，记录不同品种的序列变异信息，寻找特异的SNP位点；(5)将SNP集中区域作为目的片段，设计引物并对所有个体的DNA样品进行PCR扩增；(6)基于选择的目的片段进行单倍型分析，筛选不同品种鸡所具有的单倍型序列；(7)排除科宝肉鸡与其他品种共有的单倍型基因序列，筛选其独有的单倍型，作为科宝肉鸡独有的DNA条形码，并以此作为鉴定科宝肉鸡的标准；(8)比...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀荣，邓继贤，杨祝良，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45