一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法及其试剂盒，检测方法，包括如下内容：采集海分枝杆菌疑似感染者的脓性分泌物；提取分泌物中的DNA核酸；设计引物和探针；配制海分枝杆菌核酸检测试剂；取病灶分泌物的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；待恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果；本发明专利技术无需分离培养分枝杆菌，直接从病灶分泌物中检测海分枝杆菌核酸，具有耗时短、操作简便的优点，本发明专利技术运用独特的方法设计出的引物和探针，使得检测灵敏度高、特异性好；再通过实验优选出引物探针优选和最优的工作浓度范围，从而进一步提高试剂盒的检测的灵敏度和特异性。

A Rapid Detection Method of Mycobacterium Marinum Nucleic Acid and Its Kit

【技术实现步骤摘要】
一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法及其试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域，特别是一种海分枝杆菌核酸的检测方法及其试剂盒。
技术介绍
海分枝杆菌是一种生长在淡水和海洋中的非结核分枝杆菌，主要感染鱼类、蛙类、虾类等水生生物，也可以通过皮肤表面的微小伤口感染人类，形成肉芽肿样病变。临床患者大多因被水产品刺伤手部，或在受污染的水域游泳引起感染。海分枝杆菌的最适生长温度约为32℃，温度上升至37℃时细菌生长受到抑制。因此，临床发现的感染灶大多位于人体四肢和皮肤等温度较低的表浅位置，免疫力低下的患者有可能发生全身感染。感染症状一般表现为迁延不愈的皮肤肿块，可伴有疼痛、破溃流脓等症状，临床容易误诊为腱鞘炎、关节炎、或结核分枝杆菌感染，从而延误治疗。治疗延误有可能导致病灶大面积坏死，严重时甚至有截肢风险。因此，及时诊断病原体类型是治疗海分枝杆菌感染的首要措施。目前海分枝杆菌的诊断还没有统一标准。根据2016年《非结核分枝杆菌病实验室诊断专家共识》，海分枝杆菌的诊断需要先从临床样本中分离培养分枝杆菌，再通过分子生物学方法进行菌种鉴定，最终锁定致病菌。海分枝杆菌虽然属于快速生长的分枝杆菌，但分离培养依然需要至少一周到两周时间，再加上后续菌种鉴定的耗时，极大地耽误了患者的确诊和治疗时间。市场需要一种无需分离培养分枝杆菌，直接从病灶分泌物中检测海分枝杆菌核酸的方法，本专利技术解决这样的问题。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法及其试剂盒，本专利技术无需分离培养分枝杆菌，直接从病灶分泌物中检测海分枝杆菌核酸，具有耗时短、操作简便的优点，通过本方法设计出的引物和探针，使得检测灵敏度高、特异性好，具备良好的临床应用前景。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，包括如下内容：采集海分枝杆菌疑似感染者的脓性分泌物；提取分泌物中的DNA核酸；设计如下5条引物和探针，SEQIDNO.1：5’-TGTACCTGAAGGAGCGCAGT；SEQIDNO.2：5’-Biotin-GGGCTCCTTTGTTGAGGTTG；SEQIDNO.3：5’-6-FAM-GTGTCGGATCGGGCCACGTC；SEQIDNO.4：5’-GGGCTCCTTTGTTGAGGTTGGACCAGCCGCGCGATAGCAA；SEQIDNO.5：5’-TTGGTTGACACTCGAGGCAC；配制海分枝杆菌核酸检测试剂，检测试剂包括：SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，DNA聚合酶，DNA聚合酶缓冲液，MgSO4溶液，dNTP，蒸馏水，DNA样品；取病灶分泌物的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；待恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果，阳性结果：检测装置出现两条红色的指示线，两条指示线分别位于质控线(C)位置和检测线(T)位置；阴性结果：检测装置出现一条指示线，且位于质控线(C)位置；无效结果：检测装置无指示线出现。前述的一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，设计如下5条引物和探针的方法为：5条引物和探针如下：SEQIDNO.1：5’-TGTACCTGAAGGAGCGCAGT；SEQIDNO.2：5’-抗原标记物-GGGCTCCTTTGTTGAGGTTG；SEQIDNO.3：5’-抗原标记物-GTGTCGGATCGGGCCACGTC；SEQIDNO.4：5’-GGGCTCCTTTGTTGAGGTTGGACCAGCCGCGCGATAGCAASEQIDNO.5：5’-TTGGTTGACACTCGAGGCAC；步骤一，下载如下基因组序列：5条海分枝杆菌基因组序列，包括：GeneBank编号：HG917972.2，CP000854.1，CP025779.1，AP018496.1，CP024190.1，3条溃疡分枝杆菌基因组序列，包括：GeneBank编号：CP000325.1，LR135168.1，AP017624.1，19条其他分枝杆菌的基因组序列，具体如下：结核分枝杆菌GeneBank编号：NC_000962.3，牛结核分枝杆菌GeneBank编号：CP003494.1，瘰疬分枝杆菌GeneBank编号：NZ_MVIJ01000184.1，鸟分枝杆菌GeneBank编号：AE016958.1，堪萨斯分枝杆菌GeneBank编号：CP006835.1，戈登分枝杆菌GeneBank编号：NZ_LQOY01000260.1，亚洲分枝杆菌GeneBank编号：NZ_LZMH01000086.1，龟分枝杆菌GeneBank编号：CP007220.1，脓肿分枝杆菌GeneBank编号：CU458896.1，马赛分枝杆菌GeneBank编号：NZ_FVNT01000011.1，胞内分枝杆菌GeneBank编号：CP003322.1，施氏分枝杆菌GeneBank编号：UEGW01000001.1，蟾蜍分枝杆菌GeneBank编号：UATA01000001.1，土分枝杆菌GeneBank编号：LT906469.1，次要分枝杆菌GeneBank编号：NZ_LQPZ01000057.1，草分枝杆菌GeneBank编号：CP014475.1，耻垢分枝杆菌GeneBank编号：CP000480.1，产粘液分枝杆菌GeneBank编号：NZ_CYSI01000007.1，偶然分枝杆菌GeneBank编号：CP011269.1；步骤二，以海分枝杆菌E11菌株GeneBank编号：HG917972.2的基因组序列为标准模板，将其他基因组序列与标准模板进行两两比对，分别得到各基因组的比对文件；步骤三，处理比对结果，进行序列分析工作，筛选出长度600bp以上的海分枝杆菌保守的特征序列共32条；步骤四，选择海分枝杆菌E11菌株GeneBank编号：HG917972.2，碱基序号：646501-2647700的特征序列设计所述5条引物和探针。前述的一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，步骤二，以海分枝杆菌E11菌株GeneBank编号：HG917972.2的基因组序列为标准模板，使用本地BLAST软件将其他基因组序列与标准模板进行两两比对，分别得到各基因组的比对文件；步骤三，处理比对结果，进行序列分析工作，筛选出长度600bp以上的海分枝杆菌保守的特征序列；筛选方法具体为：编写Perl语言脚本，对本地BLAST软件的输出结果进行如下处理：1)过滤本地BLAST输出的基因组比对文件，保留各基因组碱基位点与标准模板碱基位点的匹配信息；2)按照标准模板碱基序号从小到大的顺序，将所有基因组碱基位点的匹配信息合并到一个文件；3)以100bp的序列长度为单元，将标准模板分割成若干个100bp的小片段，统计其他基因组在各小片段中的碱基匹配数量；4)将特征序列定义为，在该序列范围内，所有海分枝杆菌的碱基匹配数量≥95％，其他基因组的碱基匹配数量<50％；由此筛选出长度600bp以上的海分枝杆菌保守的特征序列共32条。前述的一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，SEQIDNO.2、SEQIDNO.3的抗原标记物包括：Biotin，6-FAM。前述的一种海分枝杆菌核酸的快速本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，其特征在于，包括如下内容：采集海分枝杆菌疑似感染者的脓性分泌物；提取分泌物中的DNA核酸；设计如下5条引物和探针，SEQ ID NO.1：5’‑TGT ACC TGA AGG AGC GCA GT；SEQ ID NO.2：5’‑Biotin‑GGG CTC CTT TGT TGA GGT TG；SEQ ID NO.3：5’‑6‑FAM‑GTG TCG GAT CGG GCC ACG TC；SEQ ID NO.4：5’‑GGG CTC CTT TGT TGA GGT TGG ACC AGC CGC GCG ATA GCA A；SEQ ID NO.5：5’‑TTG GTT GAC ACT CGA GGC AC；配制海分枝杆菌核酸检测试剂，检测试剂包括：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，DNA聚合酶，DNA聚合酶缓冲液，MgSO4溶液，dNTP，蒸馏水，DNA样品；取病灶分泌物的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；待恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果，阳性结果：检测装置出现两条红色的指示线，两条指示线分别位于质控线(C)位置和检测线(T)位置；阴性结果：检测装置出现一条指示线，且位于质控线(C)位置；无效结果：检测装置无指示线出现。...

【技术特征摘要】
1.一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，其特征在于，包括如下内容：采集海分枝杆菌疑似感染者的脓性分泌物；提取分泌物中的DNA核酸；设计如下5条引物和探针，SEQIDNO.1：5’-TGTACCTGAAGGAGCGCAGT；SEQIDNO.2：5’-Biotin-GGGCTCCTTTGTTGAGGTTG；SEQIDNO.3：5’-6-FAM-GTGTCGGATCGGGCCACGTC；SEQIDNO.4：5’-GGGCTCCTTTGTTGAGGTTGGACCAGCCGCGCGATAGCAA；SEQIDNO.5：5’-TTGGTTGACACTCGAGGCAC；配制海分枝杆菌核酸检测试剂，检测试剂包括：SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，DNA聚合酶，DNA聚合酶缓冲液，MgSO4溶液，dNTP，蒸馏水，DNA样品；取病灶分泌物的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；待恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果，阳性结果：检测装置出现两条红色的指示线，两条指示线分别位于质控线(C)位置和检测线(T)位置；阴性结果：检测装置出现一条指示线，且位于质控线(C)位置；无效结果：检测装置无指示线出现。2.根据权利要求1所述的一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，其特征在于，设计如下5条引物和探针的方法为：5条引物和探针如下：SEQIDNO.1：5’-TGTACCTGAAGGAGCGCAGT；SEQIDNO.2：5’-抗原标记物-GGGCTCCTTTGTTGAGGTTG；SEQIDNO.3：5’-抗原标记物-GTGTCGGATCGGGCCACGTC；SEQIDNO.4：5’-GGGCTCCTTTGTTGAGGTTGGACCAGCCGCGCGATAGCAASEQIDNO.5：5’-TTGGTTGACACTCGAGGCAC；步骤一，下载如下基因组序列：5条海分枝杆菌基因组序列，包括：GeneBank编号：HG917972.2，CP000854.1，CP025779.1，AP018496.1，CP024190.1，3条溃疡分枝杆菌基因组序列，包括：GeneBank编号：CP000325.1，LR135168.1，AP017624.1，19条其他分枝杆菌的基因组序列，具体如下：结核分枝杆菌GeneBank编号：NC_000962.3，牛结核分枝杆菌GeneBank编号：CP003494.1，瘰疬分枝杆菌GeneBank编号：NZ_MVIJ01000184.1，鸟分枝杆菌GeneBank编号：AE016958.1，堪萨斯分枝杆菌GeneBank编号：CP006835.1，戈登分枝杆菌GeneBank编号：NZ_LQOY01000260.1，亚洲分枝杆菌GeneBank编号：NZ_LZMH01000086.1，龟分枝杆菌GeneBank编号：CP007220.1，脓肿分枝杆菌GeneBank编号：CU458896.1，马赛分枝杆菌GeneBank编号：NZ_FVNT01000011.1，胞内分枝杆菌GeneBank编号：CP003322.1，施氏分枝杆菌GeneBank编号：UEGW01000001.1，蟾蜍分枝杆菌GeneBank编号：UATA01000001.1，土分枝杆菌GeneBank编号：LT906469.1，次要分枝杆菌GeneBank编号：NZ_LQPZ01000057.1，草分枝杆菌GeneBank编号：CP014475.1，耻垢分枝杆菌GeneBank编号：CP000480.1，产粘液分枝杆菌GeneBank编号：NZ_CYSI01000007.1，偶然分枝杆菌GeneBank编号：CP011269.1；步骤二，以海分枝杆菌E11菌株GeneBank编号：HG917972.2的基因组序列为标准模板，将其他基因组序列与标准模板进行两两比对，分别得到各基因组的比对文件；步骤三，处理比对结果，进行序列分析工作，筛选出长度600bp以上的海分枝杆菌保守的特征序列共32条；步骤四，选择海分枝杆菌E11菌株GeneBank编号：HG91...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓非，尤其敏，胡林，刘红伟，张建瑞，欧阳兵，吕松琴，黄山，李松鹏，张瑜书，梁桂亮，
申请(专利权)人：杭州优思达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33