胶原蛋白三肽及其制备工艺制造技术

本发明专利技术公开了胶原蛋白三肽及其制备工艺，包括以下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养；(4)菌体收集；(5)提取类人胶原蛋白；(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽。本发明专利技术所述胶原蛋白三肽，制备工艺简单方便，得到具有抗氧化能力和美白功效的类人胶原三肽，无毒副作用，可进一步加工成美白、减肥瘦身功能产品。

Collagen tripeptide and its preparation process

【技术实现步骤摘要】
胶原蛋白三肽及其制备工艺
本专利技术属于生物材料
，具体涉及一种胶原蛋白三肽及其制备工艺。
技术介绍
大分子胶原蛋白，100-1000个氨基酸构成的胶原蛋白，人体的吸收利用率有限。胶原蛋白肽，由30-50个氨基酸组成，进入体内随机合成身体各部位的蛋白质或胶原蛋白，吸收率较低。胶原蛋白三肽由3个氨基酸组成，可直接点对点被人体吸收，合成人体所需的胶原蛋白。摄取量相同的前提下，比起普通的胶原蛋白肽，胶原蛋白三肽的吸收率高出6-7倍。由其是，胶原蛋白三肽中所含的GPH的吸收率更高。因为由3个氨基酸构成可直接被小肠吸收，经血液输送到肌肤，吸收的时间更快。申请号为201310199103.0的专利技术专利公开了一种富含胶原三肽的胶原蛋白粉及其制备工艺。该专利技术的目的是提供一种富含胶原三肽的胶原蛋白粉及其该胶原蛋白粉的制备工艺，该专利技术以鱼皮为原料，先采用复合蛋白酶对鱼皮胶原蛋白进行提取并降解成小分子肽，再利用自主筛选的胶原蛋白酶对小分子肽进一步定向降解成胶原三肽，然后经离心、脱腥脱色、浓缩、喷雾干燥获得富含胶原三肽的胶原蛋白粉。该专利技术选用脂肪含量低的鱼皮为原料，在制备工艺中省去稀碱溶液浸泡脱除脂肪，减少因酸碱处理而产生的有害物质；另外，采用市售的蛋白酶、风味酶对鱼皮进行酶解后，再采用自制的胶原蛋白酶进一步将部分蛋白肽降解成胶原三肽，不仅可以提高原料中胶原蛋白的抽提率而且还显著提高胶原蛋白粉的功能性。胶原蛋白作为天然的生物资源，已广泛的应用在生物医药、化妆品、食品等行业中。目前，市场对胶原蛋白的需求量越来越大，其主要来源是利用酸碱法从动物机体中提取获得，但这种胶原蛋白虽然产量较高，但其具有水溶性差、纯度低，在临床上易出现排斥反应且存在病毒隐患等缺点，从而抑制了胶原蛋白在各行业的应用。随着生物技术的发展，人们利用转基因及基因重组技术表达胶原蛋白也获得了成功，如利用哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统及大肠杆菌表达系统等，哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白成分，但操作复杂，表达水平低，规模化生产成本较高，不易普遍推广使用，而大肠杆菌表达系统虽然表达量较高，但存在着易形成包涵体，产生较多杂蛋白等问题，从而导致后期的纯化困难，回收率低。
技术实现思路
本专利技术目的是通过如下技术方案实现的：针对现有技术中存在的上述不足，本专利技术所要解决的技术问题之一是提供一种胶原蛋白三肽，产率高、收率高，培养基采用无机盐，配制简单、价格低廉，具有抑制黑色素的美白皮肤效果，具有良好的亲水性及稳定性，同天然胶原蛋白相比，具有相近的结构和生物活性，无需变性和复性，应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。本专利技术所要解决的技术问题之二是提供一种胶原蛋白三肽的制备工艺。本专利技术提供一种胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养；(4)菌体收集；(5)提取类人胶原蛋白；(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽。具体地，本专利技术所述胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于32-34℃恒温培养36-48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；(2)种子培养；将活化后的菌种以8-10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，接种量为，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子A；将种子A以8-10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；(3)发酵培养；将种子B以5-8％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于30-34℃培养10-12小时；然后升温至42-43℃，培养2-3小时；随后降温至38-39℃，培养4-5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，乙二胺四乙酸0.8g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；在发酵培养过程中pH为6.5-6.8，溶解氧的浓度为20-40％；(4)菌体收集；将发酵液于2-4℃、以5000-6000转/分钟的转速离心40-60分钟，弃上清液，收集底部固体；将底部固体用底部固体重量200-500倍的去离子水洗涤，得到菌体；(5)提取类人胶原蛋白：将菌体和细胞破碎缓冲液以固液比1：(6-12)(g/mL)混合，在压力600-800bar的条件下匀浆20-30分钟，得到破碎液；将破碎液于2-4℃、以5000-6000转/分钟的转速离心40-60分钟，收集上清液；向上清液中加入无机盐，收集无机盐浓度为15-65％的蛋白沉淀；将蛋白沉淀和pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液以固液比1：(5-10)(g/mL)混合，用截留分子量为30kD的超滤膜进行超滤，色素、无机盐以及小分子物质透过超滤膜，相对分子量较大的类人胶原蛋白被截留，收集类人胶原蛋白截留液；将类人胶原蛋白截留液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时；(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽：将类人胶原蛋白制备成为质量分数为2-5％的胶原蛋白水溶液，采用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节胶原蛋白水溶液的pH为9.5-11；添加类人胶原蛋白重量2-3％的碱性蛋白酶，混合后于40-50℃、pH9.5-11的条件下酶解3-4小时；酶解结束，加热至90-100℃，保温5-10分钟灭酶；收集酶解液，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白三肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时。具体地，本专利技术所述胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于32-34℃恒温培养36-48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；(2)种子培养；将活化后的菌种以8-10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，接种量为，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子A；将种子A以8-10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；(3)发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.胶原蛋白三肽的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养；(4)菌体收集；(5)提取类人胶原蛋白；(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽。

【技术特征摘要】
1.胶原蛋白三肽的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养；(4)菌体收集；(5)提取类人胶原蛋白；(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽。2.根据权利要求1所述的胶原蛋白三肽的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于32-34℃恒温培养36-48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；(2)种子培养；将活化后的菌种以8-10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，接种量为，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子A；将种子A以8-10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；(3)发酵培养；将种子B以5-8％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于30-34℃培养10-12小时；然后升温至42-43℃，培养2-3小时；随后降温至38-39℃，培养4-5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，乙二胺四乙酸0.8g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；在发酵培养过程中pH为6.5-6.8，溶解氧的浓度为20-40％；(4)菌体收集；将发酵液于2-4℃、以5000-6000转/分钟的转速离心40-60分钟，弃上清液，收集底部固体；将底部固体用底部固体重量200-500倍的去离子水洗涤，得到菌体；(5)提取类人胶原蛋白：将菌体和细胞破碎缓冲液以固液比1：(6-12)(g/mL)混合，在压力600-800bar的条件下匀浆20-30分钟，得到破碎液；将破碎液于2-4℃、以5000-6000转/分钟的转速离心40-60分钟，收集上清液；向上清液中加入无机盐，收集无机盐浓度为15-65％的蛋白沉淀；将蛋白沉淀和pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液以固液比1：(5-10)(g/mL)混合，用截留分子量为30kD的超滤膜进行超滤，色素、无机盐以及小分子物质透过超滤膜，相对分子量较大的类人胶原蛋白被截留，收集类人胶原蛋白截留液；将类人胶原蛋白截留液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时；(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽：将类人胶原蛋白制备成为质量分数为2-5％的胶原蛋白水溶液，采用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节胶原蛋白水溶液的pH为9.5-11；添加类人胶原蛋白重量2-3％的碱性蛋白酶，混合后于40-50℃、pH9.5-11的条件下酶解3-4小时；酶解结束，加热至90-100℃，保温5-10分钟灭酶；收集酶解液，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白三肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时。3.根据权利要求2所述的胶原蛋白三肽的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于32-34℃恒温培养36-48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；(2)种子培养；将活化后的菌种以8-10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，接种量为，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子A；将种子A以8-10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；(3)发酵培养；将种子B以5-8％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于30-34℃、pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养10-12小时；然后升温至42-43℃，pH6.8、溶解氧浓度40％的条件下培养2-3小时；随后降温至38-39℃，于pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养4-5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓江红，
申请(专利权)人：杭州柏淼生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33