一种采用固定双酶制备N-乙酰神经氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及利用酶促反应制备N‑乙酰神经氨酸的方法，一种采用固定双酶制备N‑乙酰神经氨酸的方法，包括以下步骤：在PH为7‑9，温度为22‑32℃下，将N‑乙酰葡萄糖胺和占总反应体系浓度为0.2‑0.6mol/L的丙酮酸或丙酮酸盐与固定化N‑乙酰葡萄糖胺‑2‑差向异构酶和固定化N‑乙酰神经氨酸醛缩酶混合制备得到所述N‑乙酰神经氨酸，转化快速稳定，其中，固定化双酶不采用载体固定，制备方便。

A method for preparing N-acetylneuraminic acid by immobilized double enzymes

【技术实现步骤摘要】
一种采用固定双酶制备N-乙酰神经氨酸的方法
本专利技术涉及利用酶促反应制备N-乙酰神经氨酸的方法，一种采用固定双酶制备N-乙酰神经氨酸的方法。
技术介绍
唾液酸是一个含9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖。N-乙酰神经氨酸是唾液酸的主要代表。这类化合物可结合到糖蛋白和糖脂的末端位置，在生物识别过程中起非常重要的作用。例如在流感病毒感染宿主细胞的过程之中，流感病毒的唾液酸酶可以识别N-乙酰神经氨酸及其衍生物，并通过与唾液酸结合感染细胞并释放出复制好的病毒。如果将其唾液酸酶进行抑制，那么就可以治疗病毒导致的疾病。根据唾液酸的结构，设计其类似物，利用这种类似物结合病毒的唾液酸酶，使之失去与宿主细胞表面唾液酸结合的机会，那么病毒就可以被有效的抑制。如葛兰素公司推出的抗病毒新药zanamavir就是N-乙酰神经氨酸的类似物，它具有良好的抗病毒活性。合成N-乙酰神经氨酸类似物和含有寡糖的N-乙酰神经氨酸在研究对神经氨酸苷酶、红血球凝集素以及选凝素介导的白细胞黏附的抑制中相当重要。N-乙酰神经氨酸可以从自然资源如牛奶、蛋黄中获得，但这些来源含量低，不适合大量制备。工业生产可采用化学方法或酶法合成N-乙酰神经氨酸。然而，由于化学方法需要重复的基团保护和去保护步骤，所以采用酶法制备N-乙酰神经氨酸较为经济方便。但目前的酶法制备N-乙酰神经氨酸一般用游离态的酶转化，这种方法中的酶没有固定化酶稳定，不能反复利用，而且反应所用时间较长，效率低下。此外，采用游离态的酶转化不利于分离产物。申请号为CN200510025745.4的专利提出“一种制备N-乙酰-D-神经氨酸的方法”，使用N末端具有组氨酸残基的N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶的金属螯合亲和载体固定化酶进行催化，但是固定化酶加入载体后，载体可能和反应体系发生反应，容易引起污染，转化率低，酶和载体必须结合牢固，酶催化反应稳定性较差。
技术实现思路
针对以上问题，本专利技术提出一种采用固定双酶制备N-乙酰神经氨酸的方法，固定双酶时不需要载体，酶催化反应稳定快速。为实现以上目的，本专利技术采用一下技术方案：一种采用固定双酶制备N-乙酰神经氨酸的方法，包括以下步骤：在pH为7-9，温度为22-32℃下，将N-乙酰葡萄糖胺和占总反应体系浓度为0.2-0.6mol/L的丙酮酸或丙酮酸盐与固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶混合制备得到所述N-乙酰神经氨酸；所述固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶的固定化过程为：将N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶酶液与N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶液按总酶活比为1:（1-4）混合，冰水浴冷却后，边搅拌边加入质量分数为50-75%的硫酸铵形成沉淀，离心收集沉淀，然后加入交联剂进行交联固定，形成固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶；所述N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶酶液和N-乙酰神经氨酸醛缩酶也可以单独进行固化。本专利技术采用硫酸铵配合交联剂对N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶进行固定化，两种酶可以混合交联固定化，也可以单独采用硫酸铵配合交联剂进行交联固定化，得到的固定化酶活性强，自身固定化稳定，分子之间结合稳定。所述N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的编号是E.C.5.1.3.8，所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编号是E.C.4.1.3.3，固定化时分子之间结合更稳定，酶活性更高。优选的，交联固定时，温度为15-20℃，交联时间为3h，温度不宜过高，避免交联过程中酶失去活性，同时由于固定化时需要酶内部分子之间的结合，因此时间不宜过短，确保固定化酶自身的稳定性。优选的，所述交联剂为质量分数为25%的戊二醛溶液，戊二醛含有两个羰基，容易和N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶中的极性基团发生反应，交联后能得到更紧密的交联结构，提高固定化酶真身的强度和稳定性。进一步优选的，交联固定时，酶液中戊二醛溶液的质量分数维持在0.05-0.5%，戊二醛溶液浓度不宜过高，避免形成杂乱的多聚体。优选的，所述丙酮酸盐为丙酮酸钠，在反应体系中的浓度为0.3-0.4mol/L，对反应体系的影响较小，最终N-乙酰神经氨酸的转化率较高。优选的，固定化过程中，所述N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶酶液与N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶液的总酶活比为1-2。优选的，制备N-乙酰神经氨酸时，pH为7，温度为30℃。优选的，制备N-乙酰神经氨酸时，固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的酶活为70-120U/g，固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶的酶活为30-60U/g。优选的，制备N-乙酰神经氨酸时，在反应进行到平台期时补加丙酮酸或丙酮酸盐，使丙酮酸或丙酮酸盐的浓度维持在0.3-0.4mol/L。本专利技术的有益效果在于：本专利技术采用无载体固定化技术固定双酶来制备N-乙酰神经氨酸，通过对N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶与N-乙酰神经氨酸醛缩酶进行交联固定，不需要载体，不会对催化反应产生污染，得到的固定双酶有较高的活性，且自身结构稳定，能多次反复使用，催化过程中N-乙酰神经氨酸的转化率大大提高且稳定。具体实施方式本具体实施方法仅仅是对本专利技术的解释，并不是对本专利技术的限制。本领域技术人员在阅读了本专利技术的说明书之后所作出的任何改变，只要在权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。实施例1：一种采用固定双酶制备N-乙酰神经氨酸的方法，固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶的固定化过程为：将编号为E.C.5.1.3.8的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶酶液与编号为E.C.4.1.3.3的N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶液按总酶活比为1:2混合，冰水浴冷却后，边搅拌边加入质量分数为75%的硫酸铵形成沉淀，离心后收集沉淀，然后边搅拌边加入质量分数为25%的戊二醛溶液，在15℃下反应3h进行交联固定，形成固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶。制备N-乙酰神经氨酸的过程包括以下步骤：在pH为7，温度为30℃下，将N-乙酰葡萄糖胺和占总反应体系浓度为0.3mol/L的丙酮酸钠与酶活为70U/g的固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和酶活为30U/g的固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶混合制备得到所述N-乙酰神经氨酸，当反应进行到平台期时，补加丙酮酸钠，使其浓度维持在0.3mol/L。实施例2：一种采用固定双酶制备N-乙酰神经氨酸的方法，固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶的固定化过程为：将N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶酶液与N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶液按总酶活比为1:3混合，冰水浴冷却后，边搅拌边加入质量分数为50%的硫酸铵形成沉淀，离心收集沉淀，然后加入自身质量分数为25%的戊二醛溶液，在18℃下反应3h进行交联固定，交联固定时，酶液中戊二醛溶液的质量分数维持在0.2%，形成固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶。制备N-乙酰神经氨酸的过程包括以下步骤：在pH为9，温度为22℃下，将N-乙酰葡萄糖胺和占总反应体系浓度为0.6mol/L的丙酮酸与酶活为120U/g的固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用固定双酶制备N‑乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：在pH为7‑9，温度为22‑32℃下，将N‑乙酰葡萄糖胺和占总反应体系浓度为0.2‑0.6mol/L的丙酮酸或丙酮酸盐与固定化N‑乙酰葡萄糖胺‑2‑差向异构酶和固定化N‑乙酰神经氨酸醛缩酶混合制备得到所述N‑乙酰神经氨酸；所述固定化N‑乙酰葡萄糖胺‑2‑差向异构酶和固定化N‑乙酰神经氨酸醛缩酶的固定化过程为：将N‑乙酰葡萄糖胺‑2‑差向异构酶酶液与N‑乙酰神经氨酸醛缩酶酶液按总酶活比为1:（1‑4）混合，冰水浴冷却后，边搅拌边加入质量分数为50‑75%的硫酸铵形成沉淀，离心收集沉淀，然后加入交联剂进行交联固定，形成固定化N‑乙酰葡萄糖胺‑2‑差向异构酶和固定化N‑乙酰神经氨酸醛缩酶。

【技术特征摘要】
1.一种采用固定双酶制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：在pH为7-9，温度为22-32℃下，将N-乙酰葡萄糖胺和占总反应体系浓度为0.2-0.6mol/L的丙酮酸或丙酮酸盐与固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶混合制备得到所述N-乙酰神经氨酸；所述固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶的固定化过程为：将N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶酶液与N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶液按总酶活比为1:（1-4）混合，冰水浴冷却后，边搅拌边加入质量分数为50-75%的硫酸铵形成沉淀，离心收集沉淀，然后加入交联剂进行交联固定，形成固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶。2.根据权利要求1所述的一种采用固定双酶制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于：交联固定时，温度为15-20℃，交联时间为3h。3.根据权利要求1所述的一种采用固定双酶制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于：所述交联剂为质量分数为25%的戊二醛溶液。4.根据权利要求3所述的一种采用固定双酶制备N-乙酰神经氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴黎诚，郭小雷，章权，刘建峰，章云燕，
申请(专利权)人：湖州硕邦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33