飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar及其dsRNA在飞蝗防治中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提供飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar及其dsRNA在飞蝗防治中的应用。首先运用生物信息学方法，从飞蝗中克隆了表皮孔道形成相关基因snar，得到序列为SEQ ID NO：1的飞蝗孔道形成相关基因（Lmsnar）；设计引物，合成干扰该基因的dsRNA，并通过注射法将其注入飞蝗体腔。结果表明：Lmsnar沉默后，飞蝗分别在蜕皮前、蜕皮中或蜕皮后死亡（致死率分别为3.3%，6.7%及18.3%），并且其表皮渗透性增强；与对照相比，在干燥环境中其生存能力明显降低。本发明专利技术为基于RNA干扰的害虫防治提供新的特异性分子靶标，为害虫防治提供新的途径。

Application of Lmsnar and its dsRNA in locust control

【技术实现步骤摘要】
飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar及其dsRNA在飞蝗防治中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar及其dsRNA在飞蝗防治中的应用。
技术介绍
飞蝗是全球性的农业害虫，分布范围较广，具有极强的暴发性，常以群居形式出现且迁飞能力强。其主要以禾本科植物为食，蝗灾一旦暴发，受灾范围广，为害严重。近年来，由于长期不合理地采用化学防治，不仅对农业环境造成严重的污染，而且使得飞蝗对常用杀虫剂产生了抗药性，因此筛选新型分子靶标，研发新型绿色环保杀虫剂成为重要的社会关注热点。RNA干扰（RNAi）是指细胞利用内源性或外源性双链RNA（dsRNA）介导诱发，由特定酶参与的使同源mRNA高效特异性降解从而导致基因沉默的现象，属于转录后基因沉默。近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。RNAi不仅是研究基因功能的有力工具，同时在害虫防治方面也具有极大潜力。通过RNA干扰进行害虫防治具有如下特点：1）杀虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；2）RNA在自然界极易降解，无残留；3）对环境无毒无害，相对安全。因此，国内外学者将其称为第四代杀虫剂，RNAi技术已成为未来害虫生物防治的主要研究方向。昆虫体壁覆盖整个虫体，具有维持虫体形态，抑制体内水分蒸发和抵御外源物质入侵等作用。昆虫体壁主要由上表皮（epicuticle）、原表皮（procuticle）和真皮细胞层（epidermalcells）组成。昆虫表皮具有较强的疏水特性和保水功能，可以使虫体更好地适应相对干燥的陆地环境。昆虫表皮脂类物质的结构和含量是决定其在干燥高温等逆境环境中能否生存的主要因素。位于原表皮的孔道是脂类物质从真皮细胞到上表皮转运的主要通道。Snar在黑腹果蝇中被鉴定为一种胞外蛋白，其在防止表皮脱水及外源物质入侵等方面发挥重要作用。因此，在飞蝗中，对其理化特性及生物学功能进行深入研究具有重要的理论及实际意义。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar及其dsRNA在飞蝗防治中的应用。本专利技术由如下技术方案实现的：一种飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar，飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。所述飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。所述的飞蝗孔道形成相关基因合成的dsRNA，其核苷酸序列为SEQIDNO：3。所述的飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar合成的dsRNA，具体合成方法为：根据SEQIDNO：1通过primerpremier5.0软件设计上游引物SEQIDNO：4和下游引物SEQIDNO：5，通过PCR扩增获得SEQIDNO：3，其含有T7启动子,核苷酸序列长度为550bp；产物经T7RiboMAX™ExpressRNAiSystem（Promega）试剂盒合成dsRNA即dssnar。所述的飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar合成的dsRNA在飞蝗防治中的应用。本专利技术所述飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar的全长序列，其核苷酸序列为SEQIDNO：1。该基因全长序列是基于飞蝗转录组数据库，搜索获得的片段通过BioEdit软件对其进行拼接，设计上游引物和下游引物，通过PCR扩增、克隆测序获得。该核苷酸长度为743bp，编码177个氨基酸。本专利技术所述飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。该氨基酸序列是对SEQIDNO：1进行生物信息学分析后预测得到。生物信息学分析表明snar基因编码177个氨基酸，分子量为19.9KD，理论等电点为6.95。本专利技术所述的飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar合成的dsRNA，是根据SEQIDNO：1通过primerpremier5.0软件设计上游引物SEQIDNO：4和下游引物SEQIDNO：5，通过PCR扩增获得SEQIDNO：3，其含有T7启动子,核苷酸序列长度为550bp。进一步利用T7RiboMAX™ExpressRNAiSystem（Promega）试剂盒合成dsRNA（dssnar）。SEQIDNO：3合成的dsRNA在害虫防治中的应用：通过微量进样器将SEQIDNO：3合成的dsRNA注射进入飞蝗体腔内。结果表明：SEQIDNO：3合成的dsRNA可以特异性地沉默飞蝗孔道形成相关基因的mRNA表达，并导致飞蝗蜕皮前、蜕皮中及蜕皮后致死（致死率分别为3.3%，6.7%及18.3%），且表皮渗透性增强；在干燥环境中（湿度15±2％），其存活能力显著降低。附图说明图1：注射dsRNA24h后，飞蝗孔道形成相关基因的mRNA沉默情况（左为注射dsGFP的对照组，右为注射dsRNA的实验组）。EF1-α为内参基因。其中***，P<0.001。图2：注射dsRNA对4龄飞蝗若虫生长发育的影响（A为注射dsGFP的对照组，B为注射dsRNA的实验组）。实验组飞蝗出现蜕皮前、蜕皮中或蜕皮后死亡的表型（致死率分别为3.3%，6.7%及18.3%）。图3：注射dsRNA对飞蝗表皮通透性的影响（上为注射dsGFP的对照组，下为注射dsRNA的实验组）。实验组飞蝗表皮能够被伊红着色。图4：干燥条件下注射dsRNA若虫的存活能力。蓝色：注射dsGFP的若虫（湿度15±2％）。红色：注射dsGFP的若虫（湿度50±2％）。绿色：注射dsLmsnar的若虫（湿度15±2％）。紫色：注射dsLmsnar的若虫（湿度50±2％）。与对照相比，实验组飞蝗在干燥环境中的存活率显著降低。具体实施方式实施例1：飞蝗孔道形成相关基因的序列及其dsRNA的获得1、飞蝗孔道形成相关基因的序列获得基于飞蝗转录组数据库，采用生物信息学方法，对飞蝗孔道形成相关基因的序列进行搜索，获得Lmsnar部分序列。利用NCBI网站对序列进行Blast分析，同时结合飞蝗基因组序列获得其编码序列，利用BioEdit软件进行拼接及比对后，获得Lmsnar全长开放阅读框序列。利用primerpremier5.0软件设计上游引物和下游引物，并送往上海生工生物工程股份有限公司合成。提取飞蝗5龄若虫总RNA，采用M-MLV反转录酶（TaKaRa公司）将所提总RNA反转录成第一链cDNA，并以此做为模板，结合设计的上下游引物，进行PCR扩增，产物经GelExtractionKit（Sigma）试剂盒进行纯化，连接pEASY-T3载体（北京全式金生物技术有限公司）并转化到大肠杆菌Trans-T1感受态（北京全式金生物技术有限公司）中，送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序并提取质粒。结果获得孔道形成相关基因全长开放阅读框序列，其序列为SEQIDNO：1。利用ExPASy网站translatetool对其ORF序列进行翻译，并预测蛋白分子量大小及等电点（pI）。其序列为SEQIDNO：2。该基因编码177个氨基酸，分子量为19.9KD，理论等电点为6.95。2、飞蝗孔道形成相关基因的dsRNA合成1）飞蝗孔道形成相关基因的dsRNA引物设计基于本研究所得到飞蝗孔道形成相关基因的序列SEQIDNO：1，采用primerpremier5.0软件设计d本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种飞蝗孔道形成相关基因

【技术特征摘要】
1.一种飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar，其特征在于：飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的一种飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar，其特征在于：所述飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.根据权利要求1述的飞蝗孔道形成相关基因Lmsnar合成的dsRNA，其特征在于：具体合成方法为：根据SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫敏，赵艺妍，赵小明，张建珍，马恩波，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14