本发明专利技术提供一株用于预防对虾弧菌病的芽孢杆菌，为芽孢杆菌BHK201801株,于2019年3月6日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:17307。本发明专利技术所提供的芽孢杆菌能对凡纳滨对虾养殖过程中的常见弧菌起到有效的抑制作用，通过将芽孢杆菌添加至饲料中并饲喂对虾使其于对虾体内定殖从而起到预防凡纳滨对虾弧菌病的作用。
A strain used to prevent or treat vibriosis of shrimp
The present invention provides a Bacillus strain BHK201801, which is used to prevent vibriosis of shrimp. It is stored in the General Microbial Center of China Microbial Species Preservation Management Committee of the Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, No. 3, Beichenxi Road, Chaoyang District, Beijing, on March 6, 2019, and the storage number is CGMCC NO:17307. The Bacillus provided by the invention can effectively inhibit the common Vibrio in the process of shrimp culture, and can prevent the Vibrio disease of shrimp by adding the Bacillus into the feed and feeding the shrimp to colonize the shrimp.
【技术实现步骤摘要】
一株用于预防或治疗对虾弧菌病的菌株
本专利技术属于有益菌筛选及应用
，具体涉及一株用于预防或治疗对虾弧菌病的菌株。
技术介绍
凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamai)因其肉质鲜美、生长速度快、抗逆性强等特点，自20世纪80年代引入中国后，迅速发展为我国对虾养殖的主要品种，目前其产量占对虾养殖产量的75％以上。近年来，随着凡纳滨对虾养殖业的迅速发展，病害问题日益凸显，严重损害着对虾养殖户的利益，阻碍对虾养殖业进一步的发展。弧菌病是对虾养殖过程中的主要病害之一，具有流行广、发病率高、危害大和死亡率高等特点。目前，已被确定能引起对虾弧菌病的病原有哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)、创伤弧菌(V.vulnificus)、坎贝氏弧菌(V.campbelli)和霍乱弧菌(V.cholerae)等。抗生素等药物是防治对虾弧菌病的有效手段，但同样也会引起耐药细菌的出现并引起一系列环境问题甚至危害人类健康。因此，亟需找到一种新的环境友好的有效手段用于凡纳滨对虾养殖过程中弧菌病的防治。益生菌已被证明能够通过多种作用机制对宿主起到保护作用，被认为是抗生素的良好替代品。目前，已有研究表明益生菌可以在对虾养殖过程中起到积极的作用，但益生菌的选择至关重要，许多商用益生菌的实际应用效果不理想，这与益生菌的种类及来源密切相关。而且，研究发现相对于陆地源益生菌，从水产养殖动物或环境中分离出的细菌具有更加显著的益生效果。因此，从健康对虾体内筛选得到具有弧菌拮抗活性的芽孢杆菌对于对虾养殖过程中弧菌病的防治至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株用于预防对虾弧菌病的芽孢杆菌，能够有效的对对虾养殖过程中的常见弧菌起到抑制作用，从而有效降低因弧菌病引起的对虾的高死亡率。本专利技术所提供的芽孢杆菌，为芽孢杆菌(Bacillussp.)BHK201801株,于2019年3月6日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:17307；本专利技术的芽孢杆菌筛选自健康凡纳滨对虾体内，可以用于抑制对虾养殖过程中的常见弧菌；本专利技术所提供的芽孢杆菌用于添加至饲料中，含芽孢杆菌的饲料用于预防凡纳滨对虾弧菌病。本专利技术所提供的芽孢杆菌能对凡纳滨对虾养殖过程中的常见弧菌起到有效的抑制作用，通过将芽孢杆菌添加至饲料中并饲喂对虾使其于对虾体内定殖从而起到预防凡纳滨对虾弧菌病的作用。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：具有抑菌效果的芽孢杆菌的筛选与鉴定1、样品采集样品为发生弧菌病后存活的凡纳滨对虾，将凡纳滨对虾进行表面消毒后，取肝胰腺及肌肉在无菌生理盐水中研磨并稀释至合适浓度，然后用无菌枪头吸取适量匀浆液涂布于LB固体培养基(纯水1000mL、蛋白胨10g、酵母粉5g、琼脂20g、NaCl30g、pH7.2～7.4)上，28℃下培养24h，准备进一步筛选。2、细菌富集用无菌接种环在LB固体培养基上挑取形态大小不同的单菌落置于10mL的LB液体培养基(纯水1000mL、蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl30g、pH7.2～7.4)中，放在摇床(28℃，180r/min)上进行好氧培养，培养24h后，获得纯菌株。最终从LB固体培养基上挑取并能成功富集的细菌有37株，分别编号为：BD1、BD2、BD3、BD4、BD5、BD6、BD7、BD8、BD9、BD10、BD11、BD12、BD13、BD14、BD15、BD16、BD17、BD18、BD19、BD20、BD21、BD22、BD23、BD24、BD25、BD26、BD27、BD28、BD29、BD30、BD31、BD32、BD33、BD34、BD35、BD36、BD37。3、芽孢杆菌的分离配置刺激芽孢产生培养基，配方为：海水1000mL、蛋白胨10g、酵母膏3g、淀粉3g、MgSO40.1g、KH2PO41.5g、Na2HPO42g、NaCl30g、pH7.8。将分离出的单菌落接种于刺激芽孢产生的培养基中，于恒温摇床(28℃，180r/min)培养24h。培养好的菌液置于80℃条件下水浴20min以筛选能够产生芽孢的菌株。将水浴后的菌液用无菌生理盐水稀释至合适浓度后涂布于LB固体培养基上，于28℃条件下培养24h。经过筛选，共分离出15株疑似芽孢杆菌，分别为BD1、BD2、BD3、BD4、BD15、BD18、BD19、BD22、BD23、BD24、BD27、BD28、BD31、BD36、BD37。4、具有抑菌效果的芽孢杆菌的筛选以坎贝氏弧菌C-L株、副溶血弧菌LY-L株、哈维氏弧菌HAH株、新喀里多尼亚弧菌(V.neocaledonicus)W-B株、木糖葡萄球菌(Staptococcusxylosus)W-S株、荧光弧菌Y-1、Y-2、Y-92株等实验室前期筛选得到的能够引起凡纳滨对虾弧菌病的菌株做为病原菌。采用滤纸片法筛选得到具有抑菌效果的芽孢杆菌。将病原菌和芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，于恒温摇床(28℃，180r/min)培养24h后，取200μl病原菌菌液均匀涂在LB固体培养基表面。菌液干燥后，将无菌滤纸片(6mm)贴于上方，并将10μL芽孢杆菌菌液添加至滤纸片上，空白对照组添加相同体积的无菌LB液体培养基。于30℃条件下培养24h后，观察是否产生抑菌圈并用游标卡尺测量抑菌圈直径。实验结果表明有3株芽孢杆菌(BD4、BD22、BD28)能对至少1种病原菌具有抑菌效果，其中BD28效果最好，对C-L、HAH、W-S、Y-1、Y-2、Y-92均有明显的抑制效果，抑菌圈直径分别为6.51mm、13.76mm、10.29mm、6.71mm、8.77mm、7.60mm。其次是BD22，对Y-2和Y-92具有明显的抑制效果，抑菌圈直径分别为7.96mm和7.02mm；而BD4只对W-S具有抑制效果，抑菌圈直径为8.07mm。5.细菌鉴定选取抑菌效果最好的菌株BD28在LB固体培养基上呈白色，不透明，表面光滑且边缘整齐。革兰氏染色结果为阳性，直杆状，有芽孢无荚膜。对菌株BD28进行16SrDNA的基因序列测定，并在NCBI中用BLAST进行同源序列比对，然后用MEGA5.0对测序结果进行系统发育分析以确定菌株种类。经鉴定，菌株BD28与沙福芽孢杆菌具有最高的相似性，命名为芽孢杆菌(Bacillussp.)BHK201801株,于2019年3月6日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:17307。实施例2：不同源芽孢杆菌对对虾生长、成活率及应激的影响以来自于健康对虾体内的芽孢杆菌BHK201801株和陆地源芽孢杆菌LD05做为实验菌株。将芽孢杆菌BHK201801株和LD05接种于LB液体培养基中培养24h后，离心(2392×g,10min)并用无菌生理盐水稀释至合适浓度，均匀地搅拌到对虾配合饲料中，使其终浓度为1×107cfu/g。将饲料于35℃条件下烘干并保存在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种芽孢杆菌，其特征在于，所述的芽孢杆菌为芽孢杆菌(Bacillus sp.)BHK201801株,于2019年3月6日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:17307。
【技术特征摘要】
1.一种芽孢杆菌，其特征在于，所述的芽孢杆菌为芽孢杆菌(Bacillussp.)BHK201801株,于2019年3月6日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:17307。2.权利要求1所述的芽孢杆菌筛选自健康凡纳滨...
【专利技术属性】
技术研发人员：单洪伟，于鹏，马甡，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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