本发明专利技术涉及一组用于诊断粘多糖病Ⅱ型的生物标志物及其应用，所述的生物标志物是尿液中的α1‑抗胰蛋白酶(alpha1‑antitrypsin，AAT)，Gm2激活剂(Gm2activator，GM2A)及脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin‑type prostaglandin D synthase，L‑PGDS)。
Biomarkers for the diagnosis of mucopolysaccharidosis type II and their application
The present invention relates to a set of biomarkers for the diagnosis of mucopolysaccharidosis type II and their applications. The biomarkers are alpha 1 antitrypsin (AAT), Gm2 activator (GM2A) and lipocalin type prostaglandin D synthase (L PGDS) in urine.
【技术实现步骤摘要】
用于诊断粘多糖病Ⅱ型的生物标志物及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体而言，涉及用于诊断粘多糖病Ⅱ型的生物标志物及其应用。
技术介绍
粘多糖病Ⅱ型(mucopolysaccharidosistypeⅡ，MPSⅡ)，即Hunter综合征，为我国报道最为常见的MPS类型，是由于溶酶体内艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)缺陷，从而导致分解不完全的硫酸皮肤素(dermatinsulfate，DS)和硫酸类肝素(heparansulfate，HS)在全身各组织和器官中累积的伴X隐性遗传的代谢性疾病。该病的临床表现为全身骨骼发育不良、面容粗陋、肝脾肿大等。重型患儿多于18-36个月时发病，青春期时死亡，预后十分不良。由于早期诊断，特别是对婴儿诊断的不及时，会造成患者的发育、神经、生理的不可逆改变[1]。同时，该病的致病机制尚未得到完全阐明，阻碍了疾病治疗方法的探索。因此，亟需简单可靠的诊断方法辅助早期诊断，并为寻求新的治疗方法提供实验基础。蛋白质组学研究不仅有助于寻找特异性分子标志物，也能为疾病机制的阐明提供理论根据。尿液蛋白约30％来源于血浆蛋白，包含多种生物标志，可以间接反映血浆蛋白的组成。采用尿液作为蛋白质组学的研究对象具有以下优点：首先尿液收集是非侵入性的，便于多次留取，适合以此作为监测疾病进展和疗效的反映；其次尿液中包含的小分子蛋白和多肽不需过多的处理步骤便可直接分析，避免了由蛋白水解所带来的变异性与复杂性，；并且尿液是一种稳定的样本，因其储存在膀胱的过程中已被蛋白水解酶水解完全，所以合理冻存后蛋白成分不会发生太大改变。因此，利用蛋白质组学技术来检测患者尿液中的疾病标志物具有较强的可操作性与可行性。双向凝胶电泳(twodimensionalgelelectrophoresis，2-DE)是应用最为广泛的蛋白质复合物分离技术。第一向为等点聚焦电泳(isoelectricfocusingelectrophoresis，IFE)，将蛋白质按等电点分离；第二向为聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE)，将蛋白质按分子量大小分离。经过近40年的发展，2-DE仍然是蛋白质分析中的一项重要技术。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOF-MS)技术，将电离的样品从离子源转送到质量分析器，根据飞行时间得到其分子量。该方法的优势在于高通量和高灵敏度，因此适用于分析微量蛋白质。
技术实现思路
本专利技术通过2-DE联合MALDI-TOF-MS方法，研究尿液中与MPSⅡ型相关的差异蛋白，寻找该病的特异性分子标志物，为其早期诊断，监测预后及寻求新的治疗方法提供研究依据，并为探讨该病的发生机制提供实验基础。本专利技术首先涉及一组蛋白标志物在制备区分健康人和粘多糖病Ⅱ型(mucopolysaccharidosistypeⅡ，MPSⅡ)患者的诊断试剂中的应用；所述的蛋白标志物是：α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，AAT)，Gm2激活剂(Gm2activator，GM2A)及脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-typeprostaglandinDsynthase，L-PGDS)；更优选的，所述的蛋白标志物是尿液中的α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，AAT)，Gm2激活剂(Gm2activator，GM2A)及脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-typeprostaglandinDsynthase，L-PGDS)；所述的应用指单独或任意组合的制备所述的诊断试剂。本专利技术还涉及一种检测粘多糖病Ⅱ型(mucopolysaccharidosistypeⅡ，MPSⅡ)的试剂盒，所述的检测试剂盒中包括检测单独或任意组合的所述蛋白标志物的检测试剂，所述的检测试剂包括但不限于：(1)特异性结合所述蛋白标志物的抗体，所述的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、功能性抗体片段、抗体Fab区，纳米抗体、嵌合抗体、多特异性抗体等；(2)特异性结合所述蛋白标志物的配体蛋白或多肽；(3)特异性识别所述蛋白标志物的非蛋白类化合物；优选的，所述的试剂盒是，(1)酶联免疫法检测试剂盒；(2)胶体金试纸检测试剂盒；(3)化学发光检测试剂盒；所述的蛋白标志物是：α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，AAT)、Gm2激活剂(Gm2activator，GM2A)及脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-typeprostaglandinDsynthase，L-PGDS)；更优选的，所述的蛋白标志物是尿液中的α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，AAT)，Gm2激活剂(Gm2activator，GM2A)及脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-typeprostaglandinDsynthase，L-PGDS)。附图说明图1、尿样的2D凝胶：(1A，1B，1C)为健康人对照样品，(2D，2E，2F)为MPSⅡ患者样品。图2、采用ELISA法检测MPSⅡ和正常尿液中3种蛋白质的含量，2A为、2B为、2C分别为α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，AAT)、Gm2激活剂(Gm2activator，GM2A)及脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-typeprostaglandinDsynthase，L-PGDS)。图3、三种蛋白质的AUC曲线下面积图，3A为、3B为、3C分别为α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，AAT)、Gm2激活剂(Gm2activator，GM2A)及脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-typeprostaglandinDsynthase，L-PGDS)。具体实施方式实施例1、收集MPSⅡ患者和健康指标的尿样，通过2D-PAGE结合MALDI-TOF/TOF鉴定差异表达蛋白。1、丙酮法沉淀蛋白：(1)在样品中加入3-5倍体积的含丙酮溶液(含0.07％的β巯基乙醇)，-20℃2hr或静置过夜；(2)12000g低温离心5min，80％丙酮(含0.07％的β巯基乙醇)清洗3次，加入裂解液适量，低温超声促溶5min，4℃静置2hr以上。2、Bradford法蛋白样品定量：Bradford工作液配方为(500ml)：(1)425ml双蒸水、(2)15ml95％乙醇、(3)30ml85％磷酸、(4)30mlBradford储液(100mg考马斯亮蓝+50ml95％乙醇+100ml85％正磷酸，加双蒸水定容至1000ml，4℃保存)，过滤后使用。表1、蛋白标准液和样品配方表每个样品均加入1mlBradford工作液，混匀，静置5min，测定A595吸光度3、双向电泳流程3.1、第一向固相pH梯度等电聚焦电泳3.1.1、计算样品体积(银染120ug，考染1.0mg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组单独或任意组合的蛋白标志物在制备区分健康人和粘多糖病Ⅱ型(mucopolysaccharidosis type Ⅱ，MPSⅡ)患者的诊断试剂中的应用；所述的蛋白标志物是：α1‑抗胰蛋白酶(alpha1‑antitrypsin，AAT)，Gm2激活剂(Gm2 activator，GM2A)及脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin‑type prostaglandin D synthase，L‑PGDS)。
【技术特征摘要】
1.一组单独或任意组合的蛋白标志物在制备区分健康人和粘多糖病Ⅱ型(mucopolysaccharidosistypeⅡ，MPSⅡ)患者的诊断试剂中的应用；所述的蛋白标志物是：α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，AAT)，Gm2激活剂(Gm2activator，GM2A)及脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-typeprostaglandinDsynthase，L-PGDS)。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的蛋白标志物是尿液中的α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，AAT)，Gm2激活剂(Gm2activator，GM2A)及脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-typeprostaglandinDsynthase，L-PGDS)。3.一种检测粘多糖病Ⅱ型(mucopolysaccharidosistypeⅡ，MPSⅡ)的试剂盒，所述的检测试剂盒中包括检测单独的或任意组合的蛋白标志物的检测试剂，所述的检测试剂包括但不限于：(1)特异性结合所述蛋白标志...
【专利技术属性】
技术研发人员：王成彬，段晋燕，苑晓舟，孟岩，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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