一种免疫定量检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种免疫定量检测方法，包括以下步骤：步骤S1、通过标准品和拮抗剂建立竞争指数‑浓度的标准曲线方程；步骤S2、检测样品的竞争指数，根据样品的竞争指数利用标准曲线方程来计算样品中待测抗原的浓度。本发明专利技术的免疫定量检测方法通引入特殊设计抗原(拮抗剂)把样本和标准品的免疫反应建立关联，再通过双色荧光反应把荧光强度数据处理成为竞争指数，建立剂量‑竞争指数的标准曲线来定量；采用竞争指数作为定量的反应关系，不仅解决了免疫反应条件差异的影响，又能使用存储的标准曲线进行定量，不用每次随样本做标准曲线，完美解决了免疫分析(包括免疫层析)准确定量与简单方便之间的矛盾。

A Quantitative Immunoassay and Its Application

The invention discloses an immune quantitative detection method, which includes the following steps: establishing a standard curve equation of competition index concentration by standard products and antagonists; 2. The competition index of the tested sample and calculating the concentration of antigen in the sample by standard curve equation according to the competition index of the sample. The immune quantitative detection method of the present invention uses a special designed antigen (antagonist) to establish the correlation between the immune response of the sample and the standard sample, then processes the fluorescence intensity data into a competition index through a two-color fluorescence reaction, and establishes a standard curve of the dose-competition index to quantify it. The competition index is used as a quantitative reaction relationship, which not only solves the shadow of the difference of the immune reaction conditions. Sound, and can use the stored standard curve to quantify, not every time with the sample to do the standard curve, perfectly solved the contradiction between accurate quantitative immunoassay (including immunochromatography) and simple and convenient.

【技术实现步骤摘要】
一种免疫定量检测方法和应用
本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种免疫定量检测方法和应用。
技术介绍
免疫检测的定量方案有两种：制作标准曲线定量和相对比较的半定量。标准曲线一般是在其检测的线性范围内，由多个(五个或更多)已知浓度的标准品同步与样本反应，根据其剂量-反应关系确定，连接这些点并拟合生成标准曲线，再根据样本的反应值来计算其浓度，这种方法具有定量准确的优点，但需要同时检测多个浓度的标准品来制作标准曲线，一般用在ELISA、化学发光免疫检测等同时能进行多样本检测的技术中。半定量免疫检测是通过比较样本反应的程度与标准浓度(一般只有一个)的反应程度来大致确定样本浓度，常用于单个测试中，具有简单方便的优点，但定量误差大、准确度低。但是，无论是标准曲线法还是半定量法，标准品与样本之间都是各自反应，两者反应的关联度不强，无论哪一方发生问题都会影响最终定量结果的准确性。
技术实现思路
本专利技术提供一种免疫定量检测方法和应用以实现快速准确的免疫定量检测。一方面，本专利技术提供一种免疫定量检测方法，包括以下步骤：步骤S1、通过标准品和拮抗剂建立竞争指数-浓度的标准曲线方程；步骤S2、检测样品的竞争指数，根据所述样品的竞争指数利用所述标准曲线方程来计算样品中待测抗原的浓度。在本专利技术提供的免疫定量检测方法中，所述标准品中的抗原和所述样品中的待测抗原包含第一抗体识别位点和第二抗体识别位点，不含第三抗体识别位点；所述拮抗剂为包含第一抗体识别位点和第三抗体识别位点、不含第二抗体识别位点的抗原；使用第一荧光物质标记所述第二抗体，使用第二荧光物质标记所述第三抗体。在本专利技术提供的免疫定量检测方法中，所述第三抗体可识别基因工程抗原标签蛋白(包含且不限于MyC、His、GST、HA、GFP、CFP、YFP、荧光素酶等)或其他的位点，不能识别所述标准品中的抗原和所述样品中的待测抗原上的位点。在本专利技术提供的免疫定量检测方法中，可以使用特异反应的结合物和配体(包含且不限于亲和素与生物素、酶与底物、受体与配体、蛋白质与适配体等)来代替所述第三抗体及其抗原位点。在本专利技术提供的免疫定量检测方法中，所述步骤S1包括：步骤S11、将所述标准品与所述拮抗剂的混合物与标记物液体反应，去除未反应的液体；步骤S12、检测所述第一荧光物质和所述第二荧光物质的荧光强度，计算竞争指数，所述竞争指数＝所述第一荧光物质的荧光强度/所述第二荧光物质的荧光强度；步骤S13、改变所述标准品的浓度，重复步骤S11和步骤S12，得到对应的竞争指数；步骤S14、利用标准品的浓度和对应的竞争指数绘制所述标准曲线方程。在本专利技术提供的免疫定量检测方法中，所述步骤S2包括：步骤S21、将所述样品与所述拮抗剂的混合物与标记物液体反应，去除未反应的液体；步骤S22、检测所述第一荧光物质和所述第二荧光物质的荧光强度，计算竞争指数；步骤S23、根据所述样品的竞争指数和所述标准曲线方程来计算样品中待测抗原的浓度。相应地，本专利技术还提供一种通过如上所述的免疫定量检测方法在使用微孔板反应法定量检测血清中降钙素原中的应用。相应地，本专利技术还提供一种通过如上所述的免疫定量检测方法使用免疫层析法定量检测血清中降钙素原中的应用。与现有技术相比，本专利技术的免疫定量检测方法有以下优点：本专利技术的免疫定量检测方法通引入特殊设计抗原(拮抗剂)把样本和标准品的免疫反应建立关联，再通过双色荧光反应把荧光强度数据处理成为竞争指数，建立剂量-竞争指数的标准曲线来定量；采用竞争指数作为定量的反应关系，不仅解决了免疫反应条件差异的影响，又能使用存储的标准曲线进行定量，不用每次随样本做标准曲线，完美解决了免疫分析(包括免疫层析)准确定量与简单方便之间的矛盾。附图说明图1所示为本专利技术一实施例提供的免疫定量检测方法的流程图；图2所示为以荧光强度为纵坐标的标准曲线；图3所示为以竞争指数为纵坐标的标准曲线。具体实施方式下面的实施是对本专利技术的进一步说明，而非限定本专利技术的范围。本专利技术引入特殊设计抗原(拮抗剂)把样本和标准品的免疫反应建立关联，再通过双色荧光反应把荧光强度数据处理成为竞争指数，建立剂量-竞争指数的标准曲线来定量。研究表明，在一定范围内，对于同一标本多次检测结果无论差别又多大，其竞争指数差别很小，因此，使用竞争指数完全能体现免疫定量的准确性。参照图1，本专利技术提供的免疫定量检测方法包括以下步骤：步骤S1、通过标准品和拮抗剂建立竞争指数-浓度的标准曲线方程；步骤S2、检测样品的竞争指数，根据所述样品的竞争指数利用所述标准曲线方程来计算样品中待测抗原的浓度。具体地，在本专利技术中，采用一种双色免疫荧光竞争反应的模式，通过拮抗剂把标准品与样品的反应发生关联。具体设计如下：样本(标准品)检测采用相同的荧光标记，拮抗剂采用另外一种荧光标记，可以用于标记的荧光有FITC、PE、RB200、TRITC、CY3、CY5、镧系：Eu、Tb等。两种荧光的搭配注意有发射光谱交叉的荧光避免同时使用，例如FITC和PE，尽量使用荧光强度接近的两种荧光物质搭配。进一步地，在本专利技术中，待测抗原(即标准品和样品中的抗原)上包含第一抗体识别位点和第二抗体识别位点，没有第三抗体识别位点；特殊设计的抗原(即拮抗剂中的抗原)包含第一抗体识别位点和第三抗体识别位点，缺失第二抗体识别位点。所述第三抗体可识别基因工程抗原标签蛋白(如MyC、His、GST、HA、GFP、CFP、YFP、荧光素酶等)或其他的位点，不能识别所述标准品中的抗原和所述样品中的待测抗原上的位点。第三抗体及其抗原位点也可以使用其他的能特异反应的结合物和配体(如亲和素与生物素、酶与底物、受体与配体、蛋白质与适配体等)来替代。本专利技术主要用于采用双抗体夹心法来检测抗原的免疫定量检测中。对于双抗体夹心法检测：第一抗体、第二抗体均为针对某抗原上不同位点的抗体。第一抗体作为固相(包被)抗体，第二抗体作为标记抗体。第三抗体可以是通用标签抗体，也用于标记。第一抗体和标记了第一荧光物质的第二抗体与待测抗原(即标准品和样品中的抗原)间能形成双抗体夹心结构。第一抗体和标记了第二荧光物质的第三抗体能与特殊设计的抗原(即拮抗剂中的抗原)间形成双抗体夹心结构。具体地，在反应体系中，同时加入待测抗原和一定浓度的拮抗剂(特殊设计抗原)，待测抗原与拮抗剂同时与固相第一抗体竞争反应，若样本中没有待测抗原，第一抗体位点尽数被拮抗剂占据，随着待测抗原浓度的增加，第一抗体位点逐渐被待测抗原占据，拮抗剂占据的位点数量减少，去除未反应的两种抗原，再同时与不同标记的第二抗体和第三抗体反应，洗去未反应的标记抗体，分别读取两种荧光，两种荧光强度能反映待测抗原和拮抗剂的相对浓度，计算其竞争指数。在一定范围内，待测抗原的浓度与一定浓度的特殊抗原反应的竞争指数呈正相关，可以据此建立剂量-竞争指数关系进行定量。进一步地，步骤S1包括：步骤S11、将所述标准品与所述拮抗剂的混合物与标记物液体反应，去除未反应的液体；步骤S12、检测所述第一荧光物质和所述第二荧光物质的荧光强度，计算竞争指数，所述竞争指数＝所述第一荧光物质的荧光强度/所述第二荧光物质的荧光强度；步骤S13、改变所述标准品的浓度，重复步骤S11和步骤S12，得到对应的竞争指数；步骤S14、利用标准品的浓度和对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、通过标准品和拮抗剂建立竞争指数‑浓度的标准曲线方程；步骤S2、检测样品的竞争指数，根据所述样品的竞争指数利用所述标准曲线方程来计算样品中待测抗原的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种免疫定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、通过标准品和拮抗剂建立竞争指数-浓度的标准曲线方程；步骤S2、检测样品的竞争指数，根据所述样品的竞争指数利用所述标准曲线方程来计算样品中待测抗原的浓度。2.根据权利要求1所述的免疫定量检测方法，其特征在于，所述标准品中的抗原和所述样品中的待测抗原包含第一抗体识别位点和第二抗体识别位点，不含第三抗体识别位点；所述拮抗剂中的抗原包含第一抗体识别位点和第三抗体识别位点，不含第二抗体识别位点；使用第一荧光物质标记所述第二抗体，使用第二荧光物质标记所述第三抗体。3.根据权利要求2所述的免疫定量检测方法，其特征在于，所述第三抗体可识别基因工程抗原标签蛋白，不能识别所述标准品中的抗原和所述样品中的待测抗原上的位点。4.根据权利要求2所述的免疫定量检测方法，其特征在于，使用特异反应的结合物和配体来代替所述第三抗体及其抗原位点。5.根据权利要求2所述的免疫定量检测方法，其特征在于，所述步骤S1包括：步骤S11...

【专利技术属性】
技术研发人员：买制刚，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44