本发明专利技术公开了一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针及其制备方法，属于生物荧光分析技术领域。本发明专利技术的近红外荧光探针为基于苯甲酰肼结构的近红外花菁素类探针，其结构通式如下所示。利用酰肼基团R3或R4作为与环境pH作用的基团，将苯甲酰肼通过醚键和近红外荧光团(多甲川花菁IR780)相连接的方式构建得到本发明专利技术的近红外荧光探针。本发明专利技术的近红外荧光探针可用于活细胞内外源性pH及糖尿病患者身上慢性伤口发展过程中的内源性pH变化的生物成像，其合成方法简单易行，有利于在工业上推广生产。
A Near Infrared Fluorescence Probe for Responsing to pH Changes in Living Cells and Chronic Wounds and Its Preparation Method
The invention discloses a near infrared fluorescent probe which can be used to respond to the change of pH in living cells and chronic wound development and a preparation method thereof, belonging to the field of biofluorescence analysis technology. The near infrared fluorescent probe of the invention is a near infrared cyanine probe based on the structure of benzoylhydrazide, and the general formula of the structure is as follows. The near infrared fluorescence probe of the invention is constructed by connecting the benzoylhydrazide group R3 or R4 with the near infrared fluorescence group (IR780) through the ether bond. The near infrared fluorescent probe of the invention can be used for bioimaging of endogenous and exogenous pH changes in living cells and chronic wound development in diabetic patients. The synthesis method is simple and easy, and is conducive to industrial popularization and production.
【技术实现步骤摘要】
一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针及其制备方法
本专利技术涉及生物荧光分析
所用的荧光染料，具体涉及一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针及其制备方法。
技术介绍
人体是一个十分复杂的微环境系统，对于研究一些生理病理过程，pH是一个十分重要的指标。如肿瘤的pH范围约为6.4-7.2，溶酶体pH值范围约为4.0-6.0等。维持细胞组织的生理pH值或者干扰病理组织的pH值，对于临床治疗具有十分重要的科学意义。荧光成像技术具有时空分辨率高、灵敏度高、选择性好等优点，其中发射波长在650-900nm的近红外荧光染料，可有效避开组织的自吸收和自荧光干扰，同时，这个波段的荧光对细胞组织的光损伤小，穿透深度大，因此十分适合用于生物系统的成像研究和生物样品的分析研究。相比于其他的pH值测量方法，近红外荧光检测技术在研究生命体的微环境方面具有明显的优势。目前报道的许多近红外pH荧光探针主要集中在酸性组织和细胞器的研究，如肿瘤和溶酶体等，尚未见到可应用于碱性组织的近红外pH荧光探针的研究报道。生命体如人类确实存在着碱性组织如慢性伤口等，慢性伤口是一种每年困扰数百万人的疾病，主要源于由疾病如糖尿病等导致的难以愈合的伤口溃疡，慢性伤口的发生机理相当复杂，与病菌的感染及患者的身体状况有着密切联系。对慢性伤口发生、发展的监测，对于揭示其发病机理和提供合理的治疗方案有着重要的意义。据报道，慢性伤口的pH变化范围约为7.15-8.9，且其pH大小还与疾病的发展程度有关。针对当前缺乏可用于慢性伤口环境监测的手段的现实，本专利技术旨在开发具有合适碱性pKa值的近红外pH荧光探针并用于慢性伤口的监测，该专利技术有助于揭示慢性伤口的病理研究及推动相关药物的研发。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针。本专利技术的目的还在于提供所述的近红外荧光探针的制备方法。本专利技术的近红外荧光探针为基于苯甲酰肼结构的近红外花菁素类探针，利用酰肼基团作为与环境pH作用的基团，将苯甲酰肼通过醚键和近红外荧光团(多甲川花菁IR780)相连接的方式构建荧光探针。该探针在苯甲酰肼未被质子化时由于PET(photo-inducedelectrontransfer，光诱导电子转移)原理呈现出弱荧光，但是在其质子化时则呈现出强荧光，这两种转变取决于苯甲酰肼的pKa值。同时，本专利技术通过引入具有不同吸(供)电子能力的基团和改变取代基团的位置的方式构建了具有不同pKa值的近红外小分子探针库，通过筛选获得了一个具有合适pKa值(pKa＝8.01)的探针，其可应用于慢性伤口发展过程中的pH变化的成像研究。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针，其结构通式为：通式中：X为NH、CONH、NHCO、O、S、SO2、SO2NH或NHSO2；Y为卤素，F、Cl、Br或I；R1为(CH2)nR5、(CH2)mOR6或(CHR7CH2O)pR6；R2为(CH2)nR5或(CH2)mOR6；R3、R4均为H、Cl、Br、I、NO2、CN、CONHNH2、CONHNH3+或COOR7；R1、R2中：n、m、p均为0-18中的整数，R5为H或COOR6，R6为H或C1-18烷基；R3、R4中：R7为H、C1-18烷基或M，M为金属离子如Na+、K+等。优选的，通式中：X为O，Y为I，R1为CH2CH2CH3，R2为H或OCH3，R3为H、CONHNH2或CONHNH3+，R4为H、Br、CONHNH2或CONHNH3+。所述的可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针的制备方法，为如下方法中的一种：包括如下步骤的方法一：以间羟基苯甲酸甲酯作为起始原料，通过溴化、肼解、上Boc保护基、与近红外染料IR-780反应，最后脱Boc保护基，得到近红外荧光探针；包括如下步骤的方法二：以间羟基苯甲酸甲酯作为起始原料，通过肼解、上Boc保护基、与近红外染料IR-780反应，最后脱Boc保护基，得到近红外荧光探针；包括如下步骤的方法三：以4-羟基-3-甲氧基苯甲酸甲酯作为起始原料，通过肼解、上Boc保护基、与近红外染料IR-780反应，最后脱Boc保护基，得到近红外荧光探针。一种改变所述近红外荧光探针pKa值的方法，为在所述近红外荧光探针的苯甲酰肼结构上添加具有不同吸/供电子能力的基团和改变取代基团(R3、R4)的位置来改变近红外荧光探针的pKa值。所述的可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针在检测pH变化中的应用：所述的近红外荧光探针可用于活细胞内外源性pH及糖尿病患者身上慢性伤口发展过程中的内源性pH变化的生物成像。本专利技术以苯甲酰肼(含取代的苯甲酰肼)为探针与质子的作用部分，以近红外菁类染料IR-780为荧光报道基团，通过一定的连接基团(如醚键)将这两个部位连接得到可用于响应活细胞内pH变化及糖尿病患者身上慢性伤口发展过程中的内源性pH变化的近红外荧光探针。上述pH变化的pH范围包括pH7-10。本专利技术对于现有技术具有如下优点和效果：1、本专利技术提供了一种化学方法，通过在探针分子上简单添加具有不同吸(供)电子能力的基团和改变取代基团的位置来快速构建起具有不同pKa值的近红外小分子探针库。2、本专利技术中所有荧光探针的合成路线均较为简洁，操作和后处理简便，只有最后两步需要柱层析纯化，其他步骤均可通过萃取、重结晶等操作获得产物，总收率较高，有利于工业化生产。3、本专利技术的近红外荧光探针的最大发射波长为798nm，能有效避开组织的自吸收和自荧光干扰，背景干扰小。同时，这个波段的荧光对细胞组织的光损伤小，穿透深度较大，因此十分适合用于生物系统的pH变化成像研究。5、本专利技术的荧光探针显示了优良的选择性。对生理条件下各种金属阳离子、各种阴离子及多种活性氨基酸都几乎无荧光响应。6、本专利技术通过筛选，获得了一个具有合适pKa值(pKa＝8.01)的探针，实现了细胞外源性pH变化的共聚焦荧光成像，并首次把荧光小分子探针应用于糖尿病小鼠身上慢性伤口发展过程中pH变化的生物成像，目前尚无类似报道。附图说明图1是探针1(上)、2(中)、3(下)(10μM)的紫外吸收光谱对比图。图2是探针1(上)、2(中)、3(下(10μM)在激发波长为715nm处的荧光光谱对比图。图3是探针1(上)、2(中)、3(下)(10μM)在激发波长为715nm处的pKa测定对比图。图4是探针1(10μM)在激发波长为715nm处的离子选择性测试图。图5是探针1、2、3分别在5μM、10μM、20μM浓度下的细胞毒性测试图。图6是探针1(15μM)在不同pH缓冲液下的细胞共聚焦荧光图。图7是利用探针1(15μM)监测糖尿病小鼠慢性伤口模型的第1、4、7天的结果图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步详细的描述，但不应理解为对本专利技术的限制，在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1可用于活细本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针，其特征在于结构通式为：
【技术特征摘要】
1.一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针，其特征在于结构通式为：通式中：X为NH、CONH、NHCO、O、S、SO2、SO2NH或NHSO2；Y为卤素；R1为(CH2)nR5、(CH2)mOR6或(CHR7CH2O)pR6；R2为(CH2)nR5或(CH2)mOR6；R3、R4均为H、Cl、Br、I、NO2、CN、CONHNH2、CONHNH3+或COOR7；R1、R2中：n、m、p均为0-18中的整数，R5为H或COOR6，R6为H或C1-18烷基；R3、R4中：R7为H、C1-18烷基或M，M为金属离子；所述的pH变化的pH范围包括pH7-10。2.根据权利要求1所述的近红外荧光探针，其特征在于：X为O，Y为I，R1为CH2CH2CH3，R2为H或OCH3，R3为H、CONHNH2或CONHNH3+，R4为H、Br、CONHNH2或CONHNH3+。3.权利要求1或2所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为如下方法中的一种：包...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴松，麦桁棠，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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