紫草酸在制备抗乙肝病毒药物中的用途制造技术

本发明专利技术公开了紫草酸在制备抗乙肝病毒药物中的用途，属于制药领域。细胞试验结果表明：紫草酸对乙肝病毒(HBV)DNA及乙肝e抗原(HBeAg)的表达均有显著抑制作用，且呈剂量依赖性，因此具有抗HBV的活性。紫草酸能促进自噬体的形成和自噬溶酶体的降解，其抗HBV的分子机制是通过促进肝细胞发生完整的细胞自噬来干扰HBV诱导的不完整的自噬过程，从而抑制HBV的复制。以上结果表明，紫草酸对HBV具有较好的抑制作用，具备制备抗乙型肝炎等相关疾病药物的潜力。

Application of shikonic acid in preparation of anti-hepatitis B virus drugs

The invention discloses the use of shikonic acid in the preparation of anti-hepatitis B virus drugs and belongs to the pharmaceutical field. The results of cell test showed that shikonic acid could inhibit the expression of hepatitis B virus (HBV) DNA and hepatitis B e antigen (HBeAg) in a dose-dependent manner, so it had anti-HBV activity. Shikonic acid can promote the formation of autophages and the degradation of autophagic lysosomes. Its anti-HBV molecular mechanism is to interfere with the incomplete autophagy process induced by HBV by promoting the complete autophagy of hepatocytes, thus inhibiting the replication of HBV. These results indicate that shikonic acid has a good inhibitory effect on HBV and has the potential to prepare anti-hepatitis B drugs.

【技术实现步骤摘要】
紫草酸在制备抗乙肝病毒药物中的用途
本专利技术属于制药领域，涉及紫草酸在制备抗病毒药物尤其是抗乙肝病毒药物中的新用途。
技术介绍
乙肝病毒(HBV)是一种能导致机体产生急性或慢性肝炎的嗜肝性病毒。全世界约80％的肝癌是由乙型肝炎(简称乙肝)引发的，严重威胁着人类的健康。HBV是一种DNA病毒，属嗜肝DNA病毒科，是直径42nm的球形颗粒，又名Dane颗粒，有外壳和核心两部分。外壳厚7-8nm，占据有乙肝表面抗原(HBsAg)；核心直径27nm，含有部分双链、部分单链的环状DNA，DNA聚合酶，乙肝核心抗原(HBcAg)及乙肝e抗原(HBeAg)。HBVDNA的基因组约含3200个碱基对，分为长、短两条链。长链的长度固定，存在一缺口(nick)，连接有DNA聚合酶。当HBV复制时，以长链DNA为模板，内源性DNA聚合酶修补短链，使基因组成为完整的双链结构，然后进行转录。HBVDNA的长链有4个开放性读框(ORF)，即S区、C区、P区和X区。S区包括前S1、前S2和S区基因，编码前S1、前S2和S三种外壳蛋白；C区以包括前C区，C区基因编码HBcAg蛋白，前C区编码一个信号肽，在组装和分泌病毒颗粒以及在HBeAg的分泌中起重要作用；P基因编码DNA聚合酶；X基因的产物是X蛋白，其功能尚不清楚。HBVDNA的短链长度不定，不含开放读框，不编码蛋白。目前临床使用的抗HBV的药物主要有核苷类逆转录酶抑制剂(如拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定等)以及干扰素(α-干扰素和聚乙二醇化干扰素α-2a)。这些药物随着长期的使用易产生耐药性和毒副作用。因此，迫切需要开发出一些新型的抗HBV药物用于当前乙肝的预防和治疗。从丰富的植物资源中挖掘天然抗病毒药物，是开发抗HBV药物的重要途径。紫草酸是丹参中提取的一种多酚类水溶性化合物。研究表明，紫草酸可改善四氯化物引起的体内外的肝脏氧化损伤，对肝脏具有保护作用；可以保护小肠缺血再灌注损伤，而缺血再灌注损伤与活性氧(ROS)的产生密切相关；可以抑制脂多糖(LPS)或胎牛血清(FBS)诱导的ROS的产生以及ERK1/2的磷酸化，并通过抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达及其酶的活性来减轻LPS诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)的迁移；能抑制神经细胞凋亡，并能减轻四氢吡啶离子(MPP+)引起的神经毒性。此外，还有多项研究表明紫草酸具有抗炎、抗癌、抗凋亡、抗艾滋病毒(HIV)等作用。但是，对紫草酸抗HBV的作用及机制尚未见报道。自噬是真核细胞降解长寿蛋白、错误折叠蛋白和受损细胞器的重要生物学过程。大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性疾病,特别是肿瘤、神经退行性疾病及组织纤维化的发病密切相关。目前对于自噬流的检测是自噬与其相关疾病研究领域的热点。细胞自噬由多个步骤组成，其中包括:①吞噬泡的形成；②自噬体的形成；③自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体；④自噬溶酶体的降解。自噬流是这些步骤在细胞内连续出现的动态过程,自噬流中的任一环节受到阻碍均会导致细胞自噬无法完成其生物学功能。研究表明，HBV可诱导肝细胞发生不完整的自噬，并通过自噬增强其DNA的复制。HBx是HBV的编码蛋白，HBV主要由HBx调控自噬的发生。HBx通过上调高迁移率族蛋白B(HMGB1)的表达，并通过乙酰化作用促使自噬的发生，从而促进HMGB1蛋白在细胞质的定位。HBx通过与HMGB1在细胞质内结合来诱导自噬的发生。本研究发现紫草酸具有显著抑制HBVDNA复制的作用，其抗病毒分子机制是通过诱导完整的细胞自噬来干扰HBV诱导的不完整的自噬过程，从而抑制HBV的复制。本研究为开发治疗乙肝的新型药物提供了新的思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供紫草酸在制备抗乙肝病毒药物中的新用途。细胞试验结果表明：紫草酸对HBVDNA及HBeAg的表达均有显著抑制作用，且呈剂量依赖性，因此具有抗HBV活性。紫草酸能促进自噬体的形成和自噬溶酶体的降解，其抗HBV的分子机制是通过完整的细胞自噬来干扰HBV诱导的不完整的自噬过程，从而抑制HBV的复制。以上结果表明，紫草酸对HBV具有较好的抑制作用，具备制备抗乙型肝炎等相关疾病药物的潜力。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行详细地说明。1.检测相关指标及其说明HBVDNA：乙肝病毒的脱氧核糖核酸(即乙肝病毒基因)。HBVDNA是HBV感染最直接、特异性强和灵敏性高的指标。HBVDNA阳性，提示HBV复制和有传染性。HBsAg、HBeAg：乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染HBV的标志。乙型肝炎e抗原(HBeAg)是乙肝病毒核心颗粒中的一种可溶性蛋白质。在一般情况下，HBeAg埋藏于HBcAg内部，当HBcAg裂解时，HBeAg从肝细胞核内溶入血清，它的出现迟于HBsAg，而消失却早于HBsAg，所以是人体感染HBV后跟随HBsAg出现的第2个血清学抗原标志物。ATG8/微管相关蛋白1轻链3(microtubuleassociatedprotein1lightchain3,LC3)：ATG8/LC3是目前研究中被最广泛使用的分子标志物。LC3参与了自噬体膜的形成，包括两种可相互转化的形式即LC3-I和LC3-II。细胞内新合成的LC3经过加工，成为胞浆可溶形式的LC3-I，后者经泛素化加工修饰，与自噬体膜表面的PE结合，成为膜结合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体，是自噬体的标志分子，随自噬体膜的增多而增加。LC3-II的含量或LC3-II/LC3-I的比例与自噬体的数量呈正相关，在某种程度上反映了细胞的自噬活性。p62：也被称为SQSTM1，在多种细胞和组织中都有表达，可作为一个货车蛋白参与多种信号转导过程。p62可连接LC3和泛素化的底物，随后被整合到自噬体中，并在自噬溶酶体中被降解。当自噬被激活时自噬体与溶酶体融合，自噬囊泡中p62等蛋白或细胞器被溶酶体酶降解，p62水平降低；当自噬被抑制时自噬体积累，p62水平升高。因此，可以用Westernblot方法检测p62的水平，作为自噬能力变化的指征。在自噬被激活时，LC3的上调和p62的表达下降不一定有明显的关联。雷帕霉素靶点(targetofrapamycin，TOR)复合体1通过级联调控ATG基因的转录、翻译，或直接催化ATG13过磷酸化在分隔膜形成阶段负性调控自噬途径，将自噬活性保持在较低的水平。TOR是自噬途径的负性调控因子，其活性与自噬活性呈此消彼长的关系。2.材料2.1细胞株：HepG2.2.15细胞、HepG2细胞由武汉大学病毒学国家重点实验室馈赠，并由本实验室保存。2.2实验仪器1)HEARCellCO2培养箱购于Heraeus公司(德国)；2)生物安全柜购于苏净集团苏州安泰空气技术有限公司(苏州)；3)XDS-1B倒置相差显微镜购于佳源兴业科技有限公司(北京)；4)BP211D电子天平购于Startorius公司(德国)；5)JA3003电子天平购于精密科学仪器有限公司(上海)；6)凝胶成像仪及软件，BIO-RADCFXConnectTMReal-TimeSystem、BIO-RADiMARKTM酶标仪购于BIO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.紫草酸在制备抗乙肝病毒药物中的用途。

【技术特征摘要】
1.紫草酸在制备抗乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡文涛，朱诗琪，韩凤梅，陈勇，温海梅，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42