一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法技术

本发明专利技术涉及一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交（Genome in situ hybridization in suspension,GISHIS）的方法，包括细胞周期同步化、染色体悬浮液制备、基因组探针制备、样品与基因组探针变性、悬浮液中进行基因组原位杂交。滴片镜检，若悬浮液中产生绿色荧光信号，则判定为斑茅染色体，说明成功将绿色荧光标记到斑茅染色体上了。利用流式细胞仪，可以对染色体悬浮液中特异标记绿色荧光信号的斑茅染色体实现分选并进行相关测序研究，为研究复杂多倍体斑茅基因组提供了新的、有效可行的方法。本发明专利技术可应用于各种作物中属间杂交后代的染色体悬浮液中进行基因组原位杂交。

A method of genomic in situ hybridization in chromosome suspension

The present invention relates to a method of genome in situ hybridization (GISHIS) in chromosome suspension, including cell cycle synchronization, chromosome suspension preparation, genome probe preparation, sample and genome probe denaturation, and genome in situ hybridization in suspension. If green fluorescence signal is produced in suspension, the chromosome of Zebra arundinacea is determined by drip microscopy, which indicates that the green fluorescence is successfully labeled on the chromosome of Zebra arundinacea. Flow cytometry can be used to isolate and sequence the specific green fluorescent signal labeled chromosomes in chromosome suspension, which provides a new, effective and feasible method for the study of complex polyploid zebra grass genome. The present invention can be applied to in situ hybridization of genome in chromosome suspension of offspring of intergeneric hybridization in various crops.

【技术实现步骤摘要】
一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法
本专利技术涉及一种作物属间基因组原位杂交的方法，具体涉及一种染色体悬浮液中进行属间基因组原位杂交的方法，属细胞生物学

技术介绍
甘蔗近缘属野生种具有丰富遗传多样性，蕴藏着大量可用于甘蔗遗传育种的优异性状。斑茅是甘蔗遗传改良育种中备受关注的近缘属野生种之一，甘蔗育种科技人员希望通过远缘杂交的方法将斑茅等近缘属野生种导入到甘蔗背景中来拓宽甘蔗的遗传基础。经过甘蔗育种家不懈的努力，已经获得了一大批甘蔗与斑茅的杂交后代，后代中有含斑茅染色体从一条到几十条不等的无性系材料。我们可以通过在染色体玻片上进行基因组原位杂交（Genomeinsituhybridization,GISH）对甘蔗与斑茅杂交后代中斑茅染色体数目进行鉴定和统计，准确性非常高，因为在玻片上进行GISH的技术已经非常成熟了。因为在甘蔗杂交育种上利用的斑茅为六倍体，2n=60，基因组庞大，直接测序无法组装到染色体水平，会缺失许多功能基因序列和重复序列，所以可通过流式细胞仪分选甘蔗与斑茅杂交后代中的斑茅染色体进行构建BAC文库、测序，把斑茅基因组进行分解研究。在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交，并把特异荧光标记在斑茅染色体上，是一个公认的技术难题。2005年，Ma等用热变性的方法初步在大麦染色体悬浮液中进行FISH，结果只能看到很弱的荧光标记信号。2013年，Giorgi等报道在小麦中染色体悬浮液中成功进行荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridizationinsuspension，FISHIS），并利用流式细胞仪成功分选到特异标记的染色体。不过，这个技术局限于简单重复序列的探针，其他长的探针或基因组探针都无法杂交成功。然而，在染色体悬浮液中成功进行基因组原位杂交尚未见有报道。在染色体玻片上进行GISH时，37℃杂交过夜后，需要用盐溶液对非特异探针进行比较强的洗脱，所以要在染色体悬浮液上成功进行GISH，必须加入适量的盐溶液和去离子甲酰胺，以及适当的旋转速度、振动幅度，使这些因素协调才能在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在染色体悬浮液中进行属间基因组原位杂交的方法，以填补在染色体悬浮液中无法进行基因组原位杂交的空白，突破技术难点。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的。本专利技术的一种在染色体悬浮液中进行属间基因组原位杂交的方法，其特征在于杂交步骤如下：（1）避光培养催根：选择甘蔗与斑茅杂交后代根点良好的茎段，洗干净后，在25-28℃条件下，用珍珠岩颗粒为基质，表面也覆盖珍珠岩颗粒，避光培养催根，期间保持湿润；（2）细胞周期同步化处理：取步骤（1）的根尖进行细胞周期同步化处理，获取中期相细胞，通过中期相细胞获得大量的中期染色体；所述细胞周期同步化处理：在25℃的培养箱中，将蔗茎竖直放在500mL的塑料盒子中，用2.0mM羟基脲溶液处理18h；ddH2O处理5h；在2.5μM甲基胺草磷溶液中处理3h，富集足够多的中期染色体；（3）染色体悬浮液制备：用剪刀剪取步骤（2）同步化处理后的根尖部0.5-1.5cm；在4℃低温水浴锅中，用体积百分率2%甲醛固定液固定20min，TrisBuffer洗3次，5min/次；然后，切1-1.5mm根尖，每30个根尖放入装有500μLLB01缓冲液的2.0mL的离心管中；用匀浆仪，18000rpm匀浆15s，然后用50μm膜过滤，放4℃备用；（4）斑茅基因组探针制备：配制20μL荧光标记反应液，其中包含6μL0.1mMdNTPmixwithFITC，4μLNickTranslationMix，1.5μg斑茅基因组DNA，用ddH2O补足至20μL；反应液在15℃条件下反应5h，即为含有FITC荧光标记的斑茅基因组探针；Badila基因组探针制备：配制20μL无荧光标记反应液，其中包含6μL0.1mMdNTPmix，4μLNickTranslationMix，1.5μgBadila基因组DNA，用ddH2O补足至20μL；反应液在15℃条件下反应5h，即无荧光标记的Badila基因组探针；（5）变性处理：取步骤（3）过滤后的染色体悬浮液，在每管染色体悬浮液样品中加入200μL去离子甲酰胺，混匀；在99℃水浴锅中变性5min，然后转入冰水中处理10min；配制杂交液：配制100μL体系，50μLFD，10μL20×SSC，斑茅基因组探针15μL，Badila基因组探针15μL，用水补足100μL，混匀后，在99℃水浴锅中变性5min，然后转入冰水中处理10min；（6）染色体悬浮液原位杂交：取步骤（5）装有变性处理后染色体悬浮液样品的2.0mL离心管，在每管样品中加入100μL步骤（5）的杂交液；在37℃培养箱中，将样品放在旋转混匀仪上混匀、杂交；（7）杂交完成后，用离心机5000rpm离心8min，去上清液；再加入500μLLB01缓冲液用混匀仪震荡、混匀，重新悬浮染色体；取染色体悬浮液滴在玻片上，通过荧光显微镜，能检测到特异绿色荧光信号的，即为斑茅染色体。其中，步骤（1）所述避光培养催根，至根长为1-3cm。步骤（2）所述用羟基脲溶液和甲基胺草磷溶液处理，羟基脲溶液和甲基胺草磷溶液必须浸没根尖，且避光处理。步骤（2）所述足够多的中期染色体，即细胞中期指数不低于40%。步骤（4）所述荧光标记反应液中FITC的荧光为绿色荧光。步骤（4）所述基因组探针，用琼脂糖凝胶电泳检测基因组探针的长度为100-800bp。步骤（6）所述样品放在旋转混匀仪上混匀，旋转混匀仪的1个循环参数为：首先，放样品的面板与地面平行，10rpm旋转15s；然后，放样品的面板与地面的夹角转至50°，进行幅度为1°-2°的往复振动，持续5s；最后逆时针转动到50°，并进行幅度为1°-2°的往复振动，持续5s；保持这样循环旋转、振动杂交6.5h。本专利技术的优点及有益之处：1、本专利技术的杂交过程简单、省时，按照设定参数、设定步骤操作就可以，杂交仅仅需要6.5h。2、本专利技术杂交的成功率高、效果好，能成功应用于流式染色体分选，只要基因组探针制备在100-800bp范围内，杂交就能够成功。3、本专利技术的适用范围广，可应用于甘蔗及各种作物不同属间杂交后代的染色体悬浮液中杂交。具体实施方式为了进一步阐明本专利技术而不是限制本专利技术，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。实施例一、一种在染色体悬浮液中进行属间基因组原位杂交的方法，包括以下步骤：1、选择甘蔗与斑茅杂交后代根点良好的茎段，洗干净后，在26℃条件下，用珍珠岩颗粒为基质，表面也覆盖珍珠岩颗粒，避光培养催根，期间保持湿润。2、待根长至1-3cm,对根尖进行细胞周期同步化处理，以获取大量的中期相细胞，获得大量的中期染色体。细胞周期同步化步骤：在25℃的培养箱中，将蔗茎竖直放在500mL的塑料盒子中，用2.0mM羟基脲（Hydroxyurea，HU）溶液中处理18h；ddH2O处理5h；2.5μM甲基胺草磷（Amiprophos-methyl,APM）溶液中处理3h；液体必须浸没根尖，避光处理。3、染色体悬浮液制备：同步化处本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法，其特征在于杂交步骤如下：（1）避光培养催根：选择甘蔗与斑茅杂交后代根点良好的茎段，洗干净后，在25‑28 ℃条件下，用珍珠岩颗粒为基质，表面也覆盖珍珠岩颗粒，避光培养催根，期间保持湿润；（2）细胞周期同步化处理：取步骤（1）的根尖进行细胞周期同步化处理，获取中期相细胞，通过中期相细胞获得大量的中期染色体；所述细胞周期同步化处理：在25℃的培养箱中，将蔗茎竖直放在500 mL的塑料盒子中，用2.0 mM 羟基脲溶液处理18 h；ddH2O处理5 h；在2.5 μM 甲基胺草磷溶液中处理3 h，富集足够多的中期染色体；（3）染色体悬浮液制备：用剪刀剪取步骤（2）同步化处理后的根尖部 0.5‑1.5 cm；在4 ℃低温水浴锅中，用体积百分率2 %甲醛固定液固定20 min，Tris Buffer洗3次，5 min/次；然后，切1‑1.5 mm根尖，每30个根尖放入装有500 μL LB01 缓冲液的2.0 mL的离心管中；用匀浆仪，18000 rpm匀浆15 s，然后用50 μm膜过滤，放4 ℃备用；（4）斑茅基因组探针制备：配制20 μL荧光标记反应液，其中包含6 μL 0.1mM dNTP mix with FITC，4 μL Nick Translation Mix，1.5 μg 斑茅基因组DNA，用ddH2O补足至20 μL；反应液在15 ℃条件下反应5 h，即为含有FITC荧光标记的斑茅基因组探针；Badila基因组探针制备：配制20 μL无荧光标记反应液，其中包含6 μL 0.1 mM dNTP mix，4 μL Nick Translation Mix，1.5 μg Badila基因组DNA，用ddH2O补足至20 μL；反应液在15 ℃条件下反应5 h，即无荧光标记的Badila基因组探针；（5）变性处理：取步骤（3）过滤后的染色体悬浮液，在每管染色体悬浮液样品中加入200 μL 去离子甲酰胺，混匀；在99 ℃水浴锅中变性5 min，然后转入冰水中处理10 min；配制杂交液：配制100 μL体系，50 μL FD，10 μL 20×SSC，斑茅基因组探针15 μL，Badila基因组探针15 μL，用水补足100 μL，混匀后，在99 ℃水浴锅中变性5 min，然后转入冰水中处理10 min；（6）染色体悬浮液原位杂交：取步骤（5）装有变性处理后染色体悬浮液样品的2.0 mL离心管，在每管样品中加入100 μL步骤（5）的杂交液；在37 ℃培养箱中，将样品放在旋转混匀仪上混匀、杂交；（7）杂交完成后，用离心机5000 rpm离心8 min，去上清液；再加入500 μL LB01缓冲液用混匀仪震荡、混匀，重新悬浮染色体；取染色体悬浮液滴在玻片上，通过荧光显微镜，能检测到特异绿色荧光信号的，即为斑茅染色体。...

【技术特征摘要】
1.一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法，其特征在于杂交步骤如下：（1）避光培养催根：选择甘蔗与斑茅杂交后代根点良好的茎段，洗干净后，在25-28℃条件下，用珍珠岩颗粒为基质，表面也覆盖珍珠岩颗粒，避光培养催根，期间保持湿润；（2）细胞周期同步化处理：取步骤（1）的根尖进行细胞周期同步化处理，获取中期相细胞，通过中期相细胞获得大量的中期染色体；所述细胞周期同步化处理：在25℃的培养箱中，将蔗茎竖直放在500mL的塑料盒子中，用2.0mM羟基脲溶液处理18h；ddH2O处理5h；在2.5μM甲基胺草磷溶液中处理3h，富集足够多的中期染色体；（3）染色体悬浮液制备：用剪刀剪取步骤（2）同步化处理后的根尖部0.5-1.5cm；在4℃低温水浴锅中，用体积百分率2%甲醛固定液固定20min，TrisBuffer洗3次，5min/次；然后，切1-1.5mm根尖，每30个根尖放入装有500μLLB01缓冲液的2.0mL的离心管中；用匀浆仪，18000rpm匀浆15s，然后用50μm膜过滤，放4℃备用；（4）斑茅基因组探针制备：配制20μL荧光标记反应液，其中包含6μL0.1mMdNTPmixwithFITC，4μLNickTranslationMix，1.5μg斑茅基因组DNA，用ddH2O补足至20μL；反应液在15℃条件下反应5h，即为含有FITC荧光标记的斑茅基因组探针；Badila基因组探针制备：配制20μL无荧光标记反应液，其中包含6μL0.1mMdNTPmix，4μLNickTranslationMix，1.5μgBadila基因组DNA，用ddH2O补足至20μL；反应液在15℃条件下反应5h，即无荧光标记的Badila基因组探针；（5）变性处理：取步骤（3）过滤后的染色体悬浮液，在每管染色体悬浮液样品中加入200μL去离子甲酰胺，混匀；在99℃水浴锅中变性5min，然后转入冰水中处理10min；配制杂交液：配制100μL体系，50μLFD，10μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓祖湖，杨善，李雪停，吴子莺，钱旺，余凡，徐良年，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35